Cre-eoxシステムを応用した遺伝子トラップによる発生関連遺伝子の単離と解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09780686
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 荒木 喜美 熊本大学, 医学部, 助手 (90211705)
• Keywords: Cre-eox システム / ES細胞 / 遺伝子トラップ

Research Abstract

スプライスアクセプター+lox71配列+IRES+β-geo+loxP配列+pUCという構築のトラップベクター(pU-Hachi)を作製し、それをES細胞に導入、現在までに45個のES細胞クローンを単離した。それぞれのクローンからgenomicDNAを抽出し、サザンブロットでトラップベクターのintegration patternを調べ、単一コピーのintegrationあるいはhead-to-tail型の複数コピーintegrationのもの32クローンを選択した。さらに、未分化状態及び胚様体へ分化させる時のβ-geo遺伝子の発現の変化を調べ、発現パターンにより分類を行った。約4分の1のクローンは分化後に発現の上昇を示し、分化に関わる遺伝子がトラップされていると期待される。現在、選択したクローンを用いて順次キメラマウスを作製している。今までに、7つのES細胞クローンでキメマウスを作製、そのうち4ラインから掛け合わせにより、そのクローン由来のマウスを得、胎児期でのβ-geo遺伝子の発現パターンを解析している。また、いくつかのクローンについては、Creによるtransient expressionでlox配列の間のβ-geoを脱落させ、残ったpUC部分を用いて、プラスミドレスキュー法によるトラップベクター挿入部位周辺のgenoMicDNAの回収にも成功した。pUC部分がベクター導入時に欠けてしまったクローンについては、lox71配列部位へ新たなプラスミドベクターの導入し、プラスミドレスキューを行った。現在、回収したgenomicDNAの解析を進めている。

Research Products

• [Publications] Kimi Araki: "Targeted integration of DNA using mutant eox sites in embryonic stem cells" Nucleic Acids Research. vol.25,No.4. 868-872 (1997)
• [Publications] Kimi Araki: "Efficiency of recombination by Cre transient expression in embryonic stem cells : Comparison of various promoters." J.Biochem. vol.122,No.5. 977-892 (1997)
• [Publications] Ivan Rodriguez: "An early and massive wave of germinal cell apoptosts is reguired for the clevelopment of functional spermatogenesis" The EMBO Journal. vol.16 No.9. 2262-2270 (1997)
• [Publications] Ivan Rodriguez: "Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of bel2." DEevelopmental Biology. vol.184. 115-121 (1997)