OLETFラットにおけるインスリン非依存型糖尿病原因遺伝子のクローニング

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09780778
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 山田 宜永 徳島大学, 医学部, 助手 (40253207)
• Keywords: OLETF / NIDDM / subtraction / cloning / gene

Research Abstract

現在、OLETFラットにおけるインスリン非依存型糖尿病に関わる原因遺伝子のクローニングをPCR-directed subtraction cloning法を用いて行っている。糖尿病発症後に発現量が変化する遺伝子の影響を考慮しないようにするため、インスリン抵抗性及び糖尿病が顕在化していない10週齢のOLETF及び対照ラットであるLETOの膵臓よりサンプルRNAを単離した。そのRNAよりmRNAを精製した後、Super script逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。そのcDNAをAluI及びRsaI制限酵素で切断し約150〜800bp長のcDNA断片にした後、リンカーDNAをライゲートし、そのリンカーをプライマーとして用いる事で+cDNA(OLETF由来)及び-cDNA(LETO由来)をPCR増幅した。-cDNAをビオチンラベルレドライバーcDNAとした後、過剰ドライバーcDNAとトレイサ-となる+cDNAをハイブリダイゼーションした。ストレプトアビジンとの結合、さらにフェノール抽出を実行する事によりビオチンラベルcDNAを除去し、残りのものをPCR増幅した。我々は現在、その残存トレイサ-cDNAのPCR産物を得ている。同時に、ドライバーとトレイサ-を逆にした場合のPCR産物も得ている。サブトラクション前にアガロースゲル電気泳動によりスメアを示していたcDNAがサブトラクションにより明確なバンドを示す事が判明した。この事は、現時点までのPCR directed subtraction cloningになんの問題もない事を示している。今後我々は、さらに(1〜2回)サブトラクションを繰り返す事を考えている。あるいは、現時点で明確なバンドを示すものをサブクローニングし、その断片について解析(ノーザン解析及びシークエンス解析)する事も考えている。

Research Products

• [Publications] D.H.Moralejo: "X-linked locus is responsible for non-insulin-dependent tiabetes yedis in the OLETF ant" Journal of Vetermary Medical Science. 60・3. (1998)
• [Publications] D.H.Moralejo: "Mapping of the gene for rat telomerase protein comport 1(Tlp1)to chromosone 15" Experimental Animal. 47・2. (1998)
• [Publications] K.Matsumoto: "Report on rat chromosone 12" Rat Genome.3. 156-163 (1997)
• [Publications] K.Wei: "Chromosumal mapping of the T-helper immunodeficiency(thid)loins in LEL rats" Immunogenetics. 47. 99-102 (1997)