チロシンキナーゼをプローブとした感染免疫機構の解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09836007
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kitasato Institute
• Principal Investigator: 森川 裕子 社団法人北里研究所, 基礎研究所, 室長 (20191017)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 塚本 俊彦 北里大学, 薬学部, 助教授 (10236862) ; 檀原 宏文 北里大学, 薬学部, 教授 (40114558) ; 片桐 拓也 国立精神神経センター神経研究所, 診断研究部, 科学技術特別研究員 (70126100) ; 松井 英則 社団法人北里研究所, 基礎研究所, 室長補佐 (30219373) ; 菊池 雄士 社団法人北里研究所, 基礎研究所, 室長 (60262078)
• Keywords: マクロファージ分化 / チロシンキナーゼ / Pyk2 / アイソフォーム / 感染免疫 / サルモネラ

Research Abstract

昨年、我々はマクロファージの分化に伴って、チロシンキナーゼPyk2のアイソフォーム、すなわち、N末端側プロリンリッチ領域のほぼ50%を欠失する変異体が出現することを見いだした。本年度、遺伝子工学的手法を用いて、この変異体を発現ベクターに組み込んだものを作製した。このPyk2アイソフォームをCos7細胞にて一過性に発現させ、細胞可溶画分中のPyk2アイソフォーム免疫複合体をキナーゼアッセイし、チロシンリン酸化蛋白質分子群の電気泳動パターンを正常Pyk2のそれと比較したところ、我々の見いだしたPyk2アイソフォームが正常のPyk2には会合しない分子(MW80kDa)と会合することが判明した。このことから、欠失変異によってPyk2に新たな機能が付与される可能性が強く示唆された。現在、このマクロファージ分化に伴うアイソフォーム出現の意義ならびにこのPyk2アイソフォームの免疫系における機能を解析する目的で、この欠失変異体を発現ベクターpME18s neoあるいは発現制御可能なテトラサイクリン系の発現ベクターに組み込み、electroporation法にて種々の免疫系細胞株、すなわち、HL-60(前骨髄球)、THP-1(マクロファージ)、Jurkat(T細胞)、WEHI231(B細胞)に導入してstable transformantsの作製を試みている。また、PCR法を用いてPyk2の457番目のリジンをアルギニンに置換した優性抑制型変異体ならびに402番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した部分的機能抑制型変異体も作製した。来年度は、これらを駆使することによって、見いだしたPyk2アイソフォームの機能の分子機構を明らかにしたい。本年度さらにPyk2アイソフォームが新規Ras-GAP、GAP-1^mに会合することも見いだしており、これら変異体を用いて会合の分子機構に関する知見が得られるものと期待される。また、現在、チロシンキナーゼFynならびにChkを欠失したノックアウトマウスにサルモネラを感染させてその際の免疫系の動態を解析するための基礎条件を検討している。

Research Products

• [Publications] T.Takahashi, T.Yagi, S.Kakinuma, A.Kurokawa, T.Katagiri,et al: "Supression of autoimmune Dissease and of massive lymphadenopathy in MPL/MP-lpr/lpr mice lacking tyrosine kinase Fyn(p56^<fyn>)" J.Immunol.159. 2532-2541 (1997)
• [Publications] T.Yasue, H.Nishizawa, S.Aizawa, Y.Kikuchi, K.Takatsu,et al: "A critical role of Lyn and Fyn for B cell responses to CD38 ligation and interleukin5" Proc.Natl.Acad.Sci.94. 10307-10312 (1997)
• [Publications] M.Baba, Y.Kikuchi, S.Mori, H.Kimoto, S.Inui,et al: "Mouse germinal center B cells with the xid mutation retain responsiveness to anti-mouse CD40 antibodies but diminish IL-5 responsiveness" Int.Immunol.9. 1463-1473 (1997)
• [Publications] P.Gulig, T.Doyle, M.Clare-Salzer, R.Maiese&H.Matsui: "Systemic infection of mice by wild-type but not spv Salmonella typhimurium is enchanced neutralization of interferon-γ and tumor necrosis facter-α" Infect.Immun.65. 5191-5197 (1997)
• [Publications] P.Gulig, T.Doyle, J.Huges,&H.Matsui: "Analysis of host cells associated with the spv-mediated intracellular growth rate of Salmonella typhimurium in mice" Infect.Immun.66. in press (1998)
• [Publications] T.Tsukamoto, Y.Shibagaki, T.Murakoshi, M.Suzuki,et al: "Cloning and characterization oftwo human cDNA encoding the mRNA capping enzyme" Biochem.Biophys.Res.Commun.243. 101-108 (1998)
• [Publications] 片桐拓也、小林芳郎、笠原忠: "スタンダード免疫学" 丸善(印刷中), (1997)