磁気ビーズを用いたDNA多型領域のクローニングと昆虫の繁殖戦略の解明

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09839018
• Research Institution: Naruto University of Education
• Principal Investigator: 清水 宏次 鳴門教育大学, 学校教育学部, 教授 (40090427)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小汐 千春 鳴門教育大学, 学校教育学部, 助手 (60263878) ; 工藤 慎一 鳴門教育大学, 学校教育学部, 助教授 (90284330) ; 竹中 修 京都大学, 霊長類研究所・分子生理研究部門, 教授 (00093261)
• Keywords: マイクロサテライトDNA / マグネットビーズ / クローニング / 繁殖戦略 / 親子判定

Research Abstract

本年度は昨年度に引き続き、マイクロサテライト領域のクローニング方法の開発を行った。
まず、対象動物のサンプルから抽出・精製し、制限酵素で消化した150塩基対から350塩基対の長さDNA断片を、プラスミドに組み込み、大腸菌中で増殖させた後、ヘルパーファージを用いて一本鎖にし、マグネットビーズにつけた(GT)_<25>プローブを使ってマイクロサテライト領域を持つと思われるものを採取した。この際の温度設定およびバッファー中の塩濃度をさまざまに変えて実験を行い、もっともよく採取できる条件を検討した。その後、採取したマイクロサテライト領域を含むプラスミドを二本鎖にした後、再び大腸菌中で増殖させた後、プラスミドだけを分離してプラスミド中の目的のDNAの塩基配列を決定するという実験を繰り返し行った。また、採取したプラスミドが本当に目的のGT-repeat領域を含んでいるかを検証するため、ドットブロットハイブリダイゼーションを行った。その際、(GT)_<10>をジゴキシゲニンでラベリングしたものをプローブとして用い、アルカリンフォスファターゼ法による化学発光により検出した。
対象動物としては、まず蛾のDNAとして、マイマイガLymantria disparのDNAを用い、いくつかのマイクロサテライト領域の特定に成功した。また、他の節足動物への応用の可能性を検討するために、ヒラタヤスデBazillozonium nodulosumのDNAにおけるマイクロサテライト領域の特定も現在進行中である。