光周性花芽誘導の日長計機構解明のためのウキクサの形質転換実験系の開発

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09874169
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 近藤 孝男 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (10124223)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石浦 正寛 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (20132730)
• Keywords: ルシフェラ-セ / 概日性リズム / ビアラフォス / 形質転換法 / パーテイクルガン / ウキクサ / 光周性花芽誘導

Research Abstract

光周性花芽誘導が詳細に調べられているウキクサLemna gibbaG3とLemna pausicostata6746を使い、形質転換法の開発を試みた。まず、パーティクルガン装置でマーカー遺伝子を導入し形質転換体をスクリーニングした。マーカー遺伝子としてはハイグロマイシンや蛋白合成阻害剤(ビアラフォス)の耐性遺伝子を利用した。遺伝子導入後、形質転換体が分離するまで培養を続け、ハイグロマイシンやビアラフォスで選択した。その結果いくつかの耐性コロニーを得た。これらのコロニーからDNAを抽出し遺伝子の導入をSouthern blotで確認したが、有意なシグナルは得られなかった。そこで、新たに、抗生物質濃度や、遺伝子導入の条件(加速圧、距離、ウキクサの設定など)の条件を検討し、効率の良い条件を検討した。その結果、使用した機械について効率のよい、導入条件を概ね設定することができた。またハイグロマイシンは効果が現れるのに時間がかかりすぎることが判ったがビアラフォスは即効性のある作用を示し、スクリーニングに適していることが確認できた。この結果に基づき、改めて得られたスクリーニングを行い、ビアラフォス耐性コロニーを数個得ることができた。現在このコロニーへの遺伝子導入を確認しているが、ビアラフォス耐性は比較的弱く、ビアラフォスの濃度をあげると耐性を失う。そこで今後はまずプロモーターの改良を試みる予定である。さらにアグロバクテリウムを利用した減圧法によっても遺伝子導入を試みる予定である。これらがうまく行けばマーカー遺伝子とcab遺伝子のプロモーターとルシフェラ-セ遺伝子の融合遺伝子を作製し、これをウキクサへ導入し、生物発光によるウキクサの概日性リズムの測定を試みる。

Research Products

• [Publications] Kondo,T.: "Circadian rhythms in rapidly dividing cyanobacteria." Science. 275. 224-227 (1997)
• [Publications] Aoki,S.: "Circadian rhythm of the cyanobacterium Synechocystis sp.PCC6803 in the dark." J.Bacteriol.179. 5751-5755 (1997)
• [Publications] Kutsuna S.: "A Period-Extender Gene pex that Extends the Period of the Circadian Clock in the Cyanobacterium Synechococcus sp.Strain PCC7942." J.Bacteriol.in press.(1998)
• [Publications] S.S.Golden: "Cyanobacterial Circadian Rhythms." Ann Rev.Plant Physiol.48. 327-354 (1997)
• [Publications] 岩崎秀雄: "藍色細菌の生物時計" 遺伝. 51巻12号. 41-46 (1997)
• [Publications] 近藤孝男: "概日時計の分子機構:シアノバクテリアの時計遺伝子" 科学. 68巻. 138-143 (1998)