遺伝子の相同組換えを利用したイネへの外来遺伝子の導入

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09876004
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 寺田 理枝 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助手 (30137799)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 飯田 滋 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 教授 (30012777)
• Keywords: ターゲッティング / 遺伝子導入 / アグロバクテリウム法 / イネ / ハイグロマイシン耐性遺伝子 / メガティブ選抜マーカー / ジフテリア毒素(DxL-A)遺伝子

Research Abstract

イネのWaxy(澱粉合成系酵素)遺伝子を標的とした、アグロバクテリウム法によるターゲッティング法の確立を目指して、Waxy遺伝子をハイグロマイシン耐性等のマーカー遺伝子と置き換えるためのターゲッティング用ベクターの構築、アグロバクテリウム法による遺伝子導入法の効率化を進めた。大腸菌及びアグロバクテリウムの両方で有効なプラスミッド選抜マーカーのスペクチノマイシン耐性遺伝子を持つベクターを用い、このベクターに、イネで高発現が期待されるアクチン遺伝子プロモーターを持つハイグロマイシン耐性遺伝子と、ネガティブ選抜マーカーであるジフテリア毒素タンパクのAチェーン(DxL-A)遺伝子をユビキチン及びカリフラワーモザイクウィルス35S遺伝子のプロモーターと接続したものを組込んだ。さらに相同配列での組換えを引き起こすためのイネのWaxy遺伝子の5'と3'隣接領域を同ベクターに組込む予定で、現在、隣接領域のクローニングを進めている。一方、イネのアグロバクテリウムによる遺伝子導入法の効率化を計るため、基本として用いる品種「日本晴れ」以外に世代交代の早い北海道の育成品種を用いてアグロバクテリウム法の培養、開花結実までの育成条件等を検討し、本実験に適したものを選抜した。上記のターゲッティング用ベクターのイネでの有効性とハイグロマイシンの選抜条件を決定するため、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみを持つ上記のベクターをEHA101及びRecA^-のUIA143のアグリバクテリアに導入し、選抜した品種を用いて遺伝子導入を行った。UIA143は長大なターゲッティング用ベクターをアグロバクテリウムの中で安定に保持するために有効と考えられる。さらにVirGおよびE遺伝子の発現を強化するためこれらの遺伝子を持つプラスミッドをアグロバクテリウムに加えて導入した。現在、ハイグロマイシンに耐性の再生植物が得られており、今後これらの植物の解析を行い選抜条件を決定する予定である。