細胞外に有用物質を分泌する炭酸固定微生物を育種するための細胞隔合技術の開発

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09876029
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 石崎 文彬 九州大学, 農学部, 教授 (20183163)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 元太 九州大学, 農学部, 助手 (40291512) ; 田中 賢二 九州大学, 農学部, 助手 (20236582) ; 園元 謙二 九州大学, 農学部, 助教授 (10154717)
• Keywords: 化学合成独立栄養細菌 / 細胞隔合 / 水素酸化細菌 / エレクトロポレーション

Research Abstract

本研究は、化学合成独立栄養細菌において菌体外に有用物質を分泌する変異株の育種と、これを可能にする遺伝子操作技術について開発・検討を試みるものである。これまでの研究で細胞融合条件の至適化と融合株の選択・検出法について検討を行ってきたが、水素酸化細菌Alcaligenes eu trophusを通常の方法で細胞融合させるのはかなり困難なことがわかったので電気パルス遺伝子導入装置を使った融合を試みた。そして、融合株の検出・選択方法として有機酸による培地の変色を指標とする融合株検出法を開発し、多数の融合株を得ることに成功した。しかし、融合株の独立栄養的な増殖能は非常に消失しやすく、継代培養を実施することができなかった。そこで、融合操作と培養に使用する緩衝液や培地組成の影響、とくに浸透圧の影響について調べ、融合株の独立栄養能を安定化できないか検討した。その結果、高濃度のグリセロール存在下で浸透圧を高めることによりある程度、融合株の形質を安定化させることに成功した。しかし、長期の培養、とくに連続培養では融合株の形質は容易に欠落しやすいことがわかったので、次年度ではその改善を試みたいと考えている。また、水素酸化細菌の高密度培養を効率よく実施するには、培養の全期間を独立栄養条件で行うわけではなく、初期段階はバイオマス由来の有機酸などを基質として与えて従属栄養的に培養を行う必要がある。有機酸を基質として使用するには、発酵槽中の濃度を常に低く維持しながらこれを連続的に供給しなければならず、従って、有機酸濃度の自動制御培養法の開発が必須となる。そこで、培養系のpHを指標啼こして有機酸基質の供給を制御するpH-stat substrate feeding methodを開発し、これを用いた流加培養を実施し、従来にない高い菌体濃度と菌体生産性を得ることに成功した。

Research Products

• [Publications] Toshikazu Sugimoto: "Control of acetic concentration by pH-stat continuous substrate feeding in heterotrophic culture phase of two-stage cultivation of Alcaligenes eutrophus for production of P (3HB) from CO2, H2 and O2 under non-explosive condition." Biotechnol. Bioeng. (印刷中). (1999)