破骨細胞におけるシステイン・プロテアーゼ・インヒビター・シスタチンCの発現の解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09877346
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 西嶋 克司 九州大学, 歯学部, 助手 (00136508)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 輝男 九州大学, 歯学部, 教授 (60077667) ; 後藤 哲哉 九州大学, 歯学部, 助手 (70253458)
• Keywords: 破骨細胞 / シスタチンC / ノーザン ブロッテイング / in situ hybridization / 免疫組織化学

Research Abstract

(1)ラット長管骨からの破骨細胞の単離とノーザンブロッティング法によるシスタチンCmRNA発現の解析について。生後1日のラット長管骨のより採取した骨髄を培養プレートにapplyし、ラット破骨細胞の単離をおこなった。単離破骨細胞を培養プレートより剥離し、塩酸グアニジン法によりtotal RNAの抽出をおこなった。抽出RNAをア-ガロースゲルにて電気泳動後、メンブレンにトランスファーした。DIG標識オリゴDNAプローブとハイブリダイゼーション後、免疫染色にてシスタチンCmRNAのシグナルの検知をおこなった。しかしながらシスタチンCmRNAのシグナルの検知に安定性がなく、またシグナルの強度も弱いものだった。破骨細胞を純粋でかつ大量に単離し、抽出するtotal RNA量を多くすることが今後の検討課題である。
(2)in situ hybridization法による破骨細胞におけるシスタチンCmRNA発現の検索について。4週齢ラットを灌流固定後、脛骨を採取した。脱灰後、4μm凍結切片を作製し、DIG標識オリゴDNAプローブをもちいたin situ hybridization法を施行した。残念ながらシスタチンCmRNAのシグナルは、弱いか検知することができなかった。さらにコントロールのセンス鎖をハイブリダイズさせた場合でも発現が認められる場合があった。したがって、現在、ハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーション後の洗いにおける種々の条件を検討中である。
(3)免疫組織化学法による破骨細胞におけるシスタチンCの局在の検索について。蛋白質レベルでのシスタチンCの発現を検討するために、4週齢ラットを灌流固定後,脛骨を採取した。脱灰後、4μm凍結切片を作製し、抗シスタチンC抗体をもちいて、ABC法により検索した。骨組織において、シスタチンCは破骨細胞の細胞内および破骨細胞の面する骨吸収窩に局在していた。