超高分解能立体構造解析を目指した蛋白質結晶化方法の開発

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09878126
• Research Institution: Nagaoka University of Technology
• Principal Investigator: 三井 幸雄 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (40012637)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 千田 俊哉 長岡技術科学大学, 工学部, 助手 (30272868)
• Keywords: 結晶化 / 精製 / X線結晶構造解析

Research Abstract

本研究においては、高精度な蛋白質のX線結晶構造解析に必要とされる良質の結晶を作成するための方法を幾つかのサンプル(BphB,BnzB,BphC,BphD,LigAB,EtbC等)を用いて検討した。
1.蛋白質の純度と得られる結晶の関係の検討
幾つかの蛋白質においては、サンプルとして使用する蛋白質の純度が不十分な場合でも結晶を得ることが可能である。しかしながら多くの場合、そのようなサンプルを用いて結晶化を行うと双晶が生じてしまう。本研究では、蛋白質サンプルの精製度を上げることで(具体的には、精製条件の再検討を行うことで)、双晶の生成をかなりの確立で抑制できることを示すことができた。具体的には、BnzB,BphDにおいて、精製条件を改良することにより、双晶の発生を押さえることに成功した。
また、結晶化条件は同一でも精製条件を変えれば、サンプルの純度に大きな差が無い場合でも、得られる結晶の質が異なることがありえるということが、EtbCを使用した実験から示された。
2.結晶化の方法の検討
通常の条件でX線回折データを収集するには、結晶の大きさはある程度大きいほうが良い結果を与えることが多い。そこで、いったん結晶が得られた後、結晶化の方法を変更することで大きな結晶を得る試みを行った。その結果、良く用いられるHanging drop法の代わりにBatch法を採用することでより大きな結晶を容易に得られることが多いことが、BphC,BphD等を使用した実験から明らかにすることができた。

Research Products

• [Publications] Tanabe,T.,Tanaka,N.,Nonaka,T.,Mitsui,Y.,Yoshimoto,T.et al.: "Roles of the Ser146,Tyr159 and Lys163n the catalyticaction of 7α-hydroxysteroid dehydrogenase." J.Biochem.(Tokyo). 124. 634-641 (1998)
• [Publications] Sugimoto,K,Aoshima,H.,Senda,T.,Masai,E,Fukuda,M.& Mitsui,Y: "Purification and crystallization of a protocatecuate 4,5-dioxygenase LigAB from sphingomonas paucimobilis SYK-6" Protein and Peptide Letters. in Press. (1999)
• [Publications] Sugimoto,K,Senda,T.,Aoshima,H.,Masai,E,Fukuda,M.& Mitsui,Y.: "Crystal structure of an aromatic-ring-opening dioxygenase LigAB which is a protocatechuate 4,5-dioxygenase." Structure. in press. (1999)
• [Publications] 三井幸雄、千田俊哉、野中孝昌: "「遺伝」52巻,7号" X線で見る-生体高分子から生物マシーナリーヘ-, 6 (1998)