2009 Fiscal Year Annual Research Report
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09F09348
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
岡村 均 Kyoto University, 薬学研究科, 教授
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
FUSTIN J.M 京都大学, 薬学研究科, 外国人特別研究員
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| Keywords | 生体リズム / 時計遺伝子 / 質量分析 |
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| Research Abstract |
生物時計における抑制複合体の解のため、Flag-mPer2発現アデノウイルスを作製し、C57B6マウス尾静脈へ投与し、感染した肝臓を摘出後、核・細胞質分画を行った。抗Flag抗体カラムを作成し、分画内のFlag-Per2複合体をカラムへ結合させ、Flag-peptideによるFlag-Per2複合体を回収した。次に、Glycerol Gradientにより複合体の大きさで分画し、SDS-PAGEで各蛋白質を分離し、銀染色後、バンドを切り出し、MS/MS解析を行った。これにより、現在のところ、3つの蛋白質の同定した。これらの同定された蛋白質が真にFlag-mPER2に結合するかを、COS細胞に共発現して検索したところ、その結合を確認した。これら蛋白質が生体リズムの中枢である視交叉上核に発現するかどうかを検索したところ、3種とも発現していた。次に、これら蛋白質のうちの一つ蛋白質MのメッセンジャーRNAが視交叉上核でリズミックに転写制御をうけているかを、定量的in situ hybridizationで調べたところ、朝にピークを持つ、24時間リズムを示した。蛋白質FのメッセンジャーRNAは視交叉上核にてこれも弱いリズムを示した。蛋白質Fはノーザンブロッイングによる解析の結果、肺、心臓、骨格筋、脾臓を初めとする全身の組織に発現していた、また抗体による検索の結果、細胞質、核の両方に存在することが確認された。
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