2010 Fiscal Year Annual Research Report
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09F09348
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
岡村 均 京都大学, 薬学研究科, 教授
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
FUSTIN J.-M. 京都大学, 薬学研究科, 外国人特別研究員
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| Keywords | 生体リズム / 時計遺伝子 / in situ hybridization |
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| Research Abstract |
Tet-Off Flag-Per2 NIH3T3系を用いて、Doxycycline-OFFで血清刺激しリズムを惹起し、PER2蛋白質がピークになる時間帯で細胞を回収し、anti-Flag-M2抗体のカラムに吸着したものをグリセロール濃度勾配で展開し、SDS上展開の後、MAS解析を行って得られた物質Mは、in situ hybridization、RTPCR検索の結果、リズムセンターである視交叉上核だけでなく副腎、肝臓、ファイブロブラストセルラインでリズミックに発現していた。また、まったくリズムの消失したCry-nullマウスでは恒常的に高い値を示した。現在、物質Mのコンディショナルノックアウトマウスを作製し、そのリズムへの効果を検索中である。一方、同様に得られたFについては、PER2への直接結合をタグ標識した各タンパク質を用いて、in vitroで再現した。またノックアウトマウス解析の結果、ホモ接合体は胎生致死であることが判明した。ヘテロ接合体は正常に生まれ、その繁殖も正常であった。ヘテロ接合体を用いて、動物行動解析をしたところ、行動リズムはWTと比べ変動がなかった。従って、現在進行中の準備実験で、我々が独自に開発したPerl-lucレポーターシステムを導入した視交叉上核のスライスカルチャー系に、レンチウイルスを用いてshRNAを導入すると、ルシフェラーゼ発光のリズム周期が変動した。
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