高等真核生物の遺伝情報維持に関わるDNA修復酵素の同定と機能解析

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10044087
• Research Category: Grant-in-Aid for international Scientific Research
• Section: Joint Research .
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 井出 博 広島大学, 理学部, 教授 (30223126)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): MITRA Sankar テキサス大学, 医学部, 教授 ; VAN Houten B テキサス大学, 医学部, 準教授 ; KOW Yoke W. エモリー大学, 医学部, 準教授 ; 久保 喜平 大阪府立大学, 農学部, 助教授 (40117619) ; 大山 義彦 広島大学, 理学部, 教授 (30169081)
• Keywords: DAN損傷 / DNA修復酵素 / 発癌 / 遺伝病 / NTH1 / エンドヌクレアーゼ / グリコシラーゼ

Research Abstract

生体の一次遺伝情報を担うDNAには様々な内因性・外因性の因子により構造障害が発生する.その結果,遺伝情報が変異し癌や遺伝病が発生する.しかしながら,高等動物においては,XTやミスマッチ修復等いくつかの例外を除いてDNA修復に関わる酵素群の全容は未解決のままである.本研究では,現在未知の部分が多い哺乳類の塩基除去修復酵素の機能解析を行った.
まず,チミン損傷[チミングリコール(TG)・ウレア・ホルミルウラシル(FU)]およびシトシン損傷[ヒドロキシウラシル・ジヒドロウラシル]を含むDNAあるいはオリゴヌクレオチド基質を合成した.これらの基質を用いて,ヒトおよびマウスのエンドヌクレアーゼIIIホモログ(hNTH1,mNthl1)の酵素特性を検討した.hNTH1およびmNthl1遺伝子は大腸菌で発現し,ホスホセルロースおよびアフィニティーカラムで精製した.トリチウム標識したTGを含むDNAとmNthl1をインキユベートすると,TGがDNAからリリースされた.さらに,オリゴヌクレオチド基質をhNTH1およびmNthl1とインキュベート後,生成物をポリアクリルアミド電気泳動で分析した.損傷を含まない基質およびメチル基の酸化損傷FUを含む基質は酵素により切断されなかったが,他の損傷を含む基質は損傷部位で特異的に切断された.したがって,ヒトおよびマウスのエンドヌクレアーゼIIIホモログは,大腸菌のendo IIIと同様な基質特異性をもち,N-グリコシラーゼとして作用することが明らかとなった.さらに,Fpg,endo IV,endo IIIによる生成物のバンドの移動度との比較から,hNTG1・mNth1ともに鎖切断モードはβ-脱離であることが示された.

Research Products

• [Publications] Sarker A.H.: "Cloning and characterization of a mouse homologue (mNthll) of Escherichia coli endonuclease III." Journal of Molecular Biology. 282. 761-774 (1998)
• [Publications] Asaeda A.: "Repair kinetics of abasic sites in mammalian cells selectively monitored by the aldehyde reactive probe (ARP)." Nucleosides Nucleotides. 17. 503-513 (1998)
• [Publications] Ikeda S.: "Purification and characterization of human NTH1,a homolog of Escherichia coli endonuclease III.Direct identification of Lys-212 as the active residue." Journal of Biological Chemistry. 273. 21585-21593 (1998)
• [Publications] Ramana C.V.: "Activation of apurinic/apyrimidinic endonuclease in human cells by reactive oxygen species and its correlation with their adaptive response to free radicals." Proceeding of National Academy of Science U.S.A.95. 5061-5066 (1998)
• [Publications] Fung H.: "Asbestos increases mammalian AP-endonuclease gene expression,protein levels,and enzyme activity in mesothelial cells." Cancer Research. 58. 189-194 (1998)
• [Publications] Zou Y.: "Involvement of molecular chaperonins in nucleotide excision repair.Dnak leads to increased thermal stability of UvrA,catalytic UvrB loading." Journal of Biological Chemystry. 273. 12887-12892 (1998)