電子顕微鏡によるDNA蛋白顕微鏡の開発と構造細胞生物学への応用

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10044264
• Research Category: Grant-in-Aid for international Scientific Research
• Section: Joint Research .
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 臼倉 治郎 名古屋大学, 医学部, 助教授 (30143415)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 博行 Oklahoma State University, Medical School, 准教授 ; 篠原 利道 Harvard Unicersity, Medical School, 准教授 ; 山崎 哲雄 Wayne State University, Kresge Eye Instit, 教授 ; 西沢 祐治 名古屋大学, 医学部, 助手 (80252229) ; 若林 隆 名古屋大学, 医学部, 教授 (00079998)
• Keywords: 電子顕微鏡 / エネルギーフィルタ / cGMP分解酵素 / 蛋白質複合体 / 構造解析 / 光受容 / 低角度回転蒸着法 / PDE

Research Abstract

本研究は新しく開発したエネルギーフィルタ型電子顕微鏡を使用し、蛋白質分子複合体の構造解析を目的としていた。しかし、エネルギーフィルタにより特有元素のスペクトルから像を結像させるには多量の電子を必要とし、氷包埋した試料でも相当な照射損傷が起こることがわかった。したがって、更なる方法論の改良が必要である。ここでは視細胞の情報伝達系に関与する蛋白質であるcGMP分解酵素(PDE)の活性化、不活性化に伴う分子構造変化を低角度回転蒸着法で解析した。この場合でもでエネルギーフィルタ型電子顕微鏡は弾性散乱電子だけで結像させることができるので極めて鮮明な像が得られた。さて、PDEはαとβの大きなサブユニットのほかに二つの小さなγサブユニット(Pγ)からなっている(省略してPαβγγと書く)が、このPDEを純化しカラムを用いてPγを二つ持つもの(Pαβγγ)、一つ持つもの(Pαβγ)、および持たないもの(Pαβ)に分離し、それぞれのフラクションを観察した。その結果Pαβγγはそれぞれ形の違うヒモ状(変形S字型と変形F字型)のサブユニットが向かい合いリング状の構造を示すことがわかった。ところがPγが一つ外れたPαβγではリングを構成する変形F字型のサブユニットがC字型へと変化し、それにともない全体の構造も変化していることが明らかとなった。まずステレオ観察するとリングは平面に対しさらに折れ曲がったようになり、特に中心部の空間(中心孔)が減少していた。さらにPγが一つもついていないPαβでは両方のサブユニットがC字型へと変化し、それにともない両方のサブユニットはねじれの位置に移動しているようであった。すなわち、Pγはα,βサブユニットに多分一つずつ結合しており、それが活性化にともないα,βどちらが先かわからないが段階的に外れるということである。

Research Products

• [Publications] Kachi S.: "Detalled localization of photoreceptor guanylate cyclase activating protein-1 and -2 in mammalian retinas using light and electron microscopy." Exp.Eye Res.(in press). (1999)
• [Publications] Seno K.: "A possible role of RGS 9 in phototransduction: A bridge between the cGMP-phosphodiesterase system and the guanvlvl cvclase system." J.Biol.Chem.273. 22169-22172 (1998)
• [Publications] Hirako,Y.: "Cleavage of BP 180,a 180kDa bullous pemphigoid antigens,yields a 120 kDa collagenous extracellular polypeptide." J.Biol.Chem.273. 9711-971* (1998)
• [Publications] Matsuhashi,T.: "Complete suppression of ethanol-induced formation of megamitochondria by 4-hydroxy-2,2,6,6-tetra-methyl-piperidine-1-oxyl(4-oh-TEMPO)." Free Radic.Biol.Med.24. 139-147 (1998)
• [Publications] 臼倉治郎: "バイオイメージング" 共立出版(株), 266 (1998)