極限微生物に由来する多糖分解酵素の構造-活性相関と糖鎖認識機構

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10134212
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 中村 聡 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (50227899)
• Keywords: キシラナーゼ / タンパク質工学 / 糖鎖認識 / 触媒ドメイン / キシラン結合ドメイン

Research Abstract

好アルカリ性バシラス属細菌41M-1株が生産するキシラナーゼは,反応の至適をアルカリ性領域(pH9.0)に有する「好アルカリ性」の酵素である.本酵素の触媒ドメインはN末端側に位置しており,そのC末端側にはキシラン結合ドメインが連結している.本特定領域研究では,41M-1株キシラナーゼのアルカリ性条件における基質認識ならびに触媒反応機構を分子レベルで解明することを目的とする.平成10年度は,好アルカリ性に関与するアミノ酸残基の特定,ならびにキシラン結合ドメインのファージディスプレイを行った.
41M-1株キシラナーゼの好アルカリ性に関与するアミノ酸残基を特定する目的で,その触媒ドメインにアミノ酸置換を施した変異型酵素を種々調製し,野生型酵素と比較した.その結果,Asp20をAsnに,あるいはTrp144をPheに置換した変異型酵素については,反応至適pHの中性域(pH6.0)へのシフトが観察された.すなわち,これら2つのアミノ酸残基の好アルカリ性への関与,ならびにアミノ酸置換による反応至適pHの人工制御の可能性が示唆された.
41Nl-1株キシラナーゼのキシラン結合ドメインをコードするDNA断片をファージディスプレイ用ベクターに連結し,ファージディスプレイを試みた.抗41M-1株キシラナーゼ抗体を用いることにより,キシラン結合ドメインがファージディスプレイされたことが確認された.しかしながら,ファージ表面上にディスプレイされたキシラン結合ドメインの不溶性キシランへの結合能は低く,ディスプレイ効率が低いこと,あるいはディスプレイされたキシラン結合ドメインの高次構造が不適切であるなどの理由が考えられた.

Research Products

• [Publications] 中村 聡: "好アルカリ性細菌が生産する新規キシラナーゼの分子解剖" 応用糖質科学. 45. 147-154 (1998)
• [Publications] Ryousuke Mizui: "Amino Acid Substitutions at the Subunit Interface Cause Thermal Stabilization in IPMDH of Bacillus coagulans" Nucleic Acids Symposium Series. 39. 203-204 (1998)
• [Publications] Hidenori Tamanoi: "Role of Acidic Amino Acids in the Alkaline pH Optimum of Xylanase J from Alkaliphilic Bacillus sp.Strain 41M-1" Nucleic Acids Symposium Series. 39. 205-206 (1998)
• [Publications] Kazuo Umemura: "Atomic Force Microscopy of an Extremely Halophilic Archaeon Using Rapid Membrane Filtration Method" Bioimages. 6. 77-81 (1998)
• [Publications] 中村 聡: "極限条件下で機能する多糖分解酵素" 化学と生物. 36. 632-638 (1998)
• [Publications] Akiko Sugio: "Separation and Characterization of Functional Domains of Xylanase J from Alkaliphilic Bacillus sp.Strain 41M-1" Genetics,Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation. (印刷中). (1999)