1998 Fiscal Year Annual Research Report
分子レベルでのタンパク質の配向制御による新しいバイオ素子の設計
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10145216
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
横山 憲二 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助教授 (80242121)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阪口 利文 北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助手 (10272999)
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| Keywords | 化学修飾 / バイオエレクトロニクス / バイオセンサー / 固定化酵素 / 蛍光ラベル / シトクロムC / MALDI-TOF MS |
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| Research Abstract |
酵素や抗体を電極、微粒子表面に固定化し、これを効率よく利用するためには、タンパク質分子が有効に機能する部位、方向に固定化・提示する必要がある。これまでの酵素や抗体の固定化では、タンパク質のアミノ酸残基を利用する方法が用いられてきた。しかしタンパク質は同種のアミノ酸を多数有しているため、部位特異的な固定化は難しい。そこで本研究では、タンパク質の配向性を分子レベルで制御して非生物材料表面上に提示する方法を開発することを目的とした。
具体的には、タンパク質表面の近接する異なるアミノ酸残基を利用することにより、部位選択的な化学修飾を行った。すなわち、タンパク質のトレオニンThr(またはセリンSer)を3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジドで処理した後、ジスルフィド結合よりカルボキシル基とチオール基を有する蛍光性タンパク質修飾剤(1)を修飾した。次にThr(またはSer)に近接したリジンLysと1のカルボキシル基を縮合させ、最後にジスルフィド結合を切断した。この方法を用いると、Lysが近接していないThr(またはSer)から1は脱離し、Thr(またはSer)とLysが近接する部位のみ修飾されることになる。本年度は1を合成し、モデルタンパク質としてシトクロムcの化学修飾を行った。
シトクロムcの化学修飾過程を蛍光測定により調べたところ、1の化学修飾により極めて大きな蛍光強度の増加がみられた。また、ジスルフィド結合を還元し切断することにより著しい減少がみられた。すなわち、Lysが近傍に存在しなかった1の脱離が起こったと考えられる。また、各修飾段階のシトクロムcをゲルろ過クロマトグラフィー、MALDI-TOF MSにより分析した。
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[Publications] K.Yokoyama, Y.Kayanuma: "Cyclic voltammetric simulation for electrochemically mediated enzyme reaction and determination of enzyme kinetic constants" Anal.Chem.70・16. 3368-3376 (1998)
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[Publications] S.Koide, K.Yokoyama: "Electrochemical characterization of enzyme electrode based on ferrocene-containing redox polymer" J.Electroanal.Chem.(印刷中). (1999)
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[Publications] A.Yamamura, T.Sakaguchi, K.Yokoyama, et al.: "Purification and characterization of cold-active L-glutamate dehydrogenase independent of NAD(P) and oxygen" J.Biochem.(印刷中). (1999)
