環境による結合・解離制御が可能な蛋白質3次元集積化法の開発とその応用

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10145238
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 篠原 寛明 岡山大学, 工学部, 助教授 (60178887)
• Keywords: 結合・解離制御 / 蛋白質集積化 / エバネセント波蛍光測定 / ビオチンアナログ修飾 / 蛍光標識アビジン / バイオセンシング / 補酵素修飾アビジン / 電気化学触媒機能

Research Abstract

平成10年度は、アビジン蛋白質に対するビオチンとビオチンアナログの結合アフィニティの差に着目し、ビオチン分子の添加により結合・解離が制御される蛋白質集積アーキテクチャーの確立とその応用の足掛かりを作ることを目指し、次のように研究を進めた。(1) エバネセント波蛍光測定法を用いたビオチンアナログ標識蛋白質とアビジンとの固相上における結合・解離特性の検討とビオチンセンシングへの応用ビオチンあるいはビオチンアナログで標識した蛋白質を導波路上に吸着固定化し、蛍光標識したアビジンを添加した際の結合と続くビオチンの添加に伴う解離をエバネセント波蛍光測定した。一反結合したアビジンも、ビオチン添加濃度に依存して解離することが明かとなり、その解離度のビオチン添加濃度依存性よりビオチンセンシングが可能であること、またビオチンセンシング域は標識するリガンド分子とアビジンとのアフィニティに対応してシフトすることを明らかにした。さらに蛍光標識アビジンの再結合により繰り返しセンシングも可能であることを示した。(2) ビオチン標識蛋白質あるいはビオチン修飾基板へのアビジンの結合のダイナミックフォースモード(DFM)の原子間力顕微鏡を用いてマイカ基板上に吸着させたビオチン標識蛋白質とアビジンとの結合を大気中観察した。また金(111)面を蒸着したマイカ基板上にビオチン修飾を施し、アビジン分子の結合を行わせ、DFM観察を行った。ビオチン修飾基板上に結合したアビジン分子もビオチン溶液洗浄で脱離することを明かにできた。(3) PQQ修飾アビジンのビオチン修飾金電極上における集積化と電気化学触媒機能の検討PQQ修飾アビジンをビオチン修飾金電極上にアセンブリでき、アビジン表面のPQQサイトと電極間で電子移動が可能であることを明らかにした。さらにPQQアビジン集積化電極がNADHを電気化学触媒酸化できる機能性電極として応用できることを示した。

Research Products

• [Publications] Hiroaki Shinohara: "Design of Artificial Redox Proteins with Specific Binding Activity and Its Application for Biosensor Fabrication" Proceesings of the 4th International Conference on Intelligent Materials, T.Takagi (eds.). 244-245 (1998)
• [Publications] Hiroaki Shinohara: "Electron Transfer between Redox Enzymes and Electrodes through the Artificial Redox Proteins and Its Application for Biosensors" Sensors & Actuators Part B (Chemical). in press.