FISHによるマルチレプリコンの複製開始制御機構解析法の確立

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10162205
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 奥村 克純 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (30177183)
• Keywords: FISH / Replicon / DNA fiber / Bromodeoxyuridine / Histone acetylation / DNA replication

Research Abstract

本研究では、真核性染色体のもつ特徴であるマルチレプリコンの複製開始制御機構を明らかにするための新しい解析技術を、蛍光in situ hybridization(FISH)法を駆使して確立することを目指し、以下のように展開した。DNAファイバー上でのBrdU検出とFISHを併用することにより、数kbの解像度をもつ複製の進行過程を数百kbの範囲で個々の細胞で視覚的に追跡できるファイバーFISHによるレプリコン解析法の開発を行った。本年度は、基本的方法ではファイバーの検出時にDNAの一部の脱落が起こり、安定したシグナル検出ができない点を踏まえ、まず、本法の技術的基盤を見直した。ファイバー検出時のDNAの変性方法が原因であると考え、その条件を種々検討した結果、アルカリ条件下で変性させることによって、これまでの方法ではドットのつながりとして検出されたBrdUの取り込みを、分断の少ないライン状シグナルとして検出することに成功した。また、この変性条件下で検出したDNAのFISHシグナルもライン状に検出できた。BrdUとFISHの両者の同時検出にも成功したが、BrdUの検出感度の若干の低下が認められ、この点については、さらなる検討を要する。また、生細胞核内複製fociのクロモソームテリトリー内での配置を解析するため、蛍光標識ヌクレオチドを動物細胞に直接取り込ませる方法を導入して複製fociを生細胞のまま三次元イメージングし、これを固定して、FISHを行い、用いている固定法が複製fociレベルでは問題ないことを明らかにした。また、ゲノムクローンを用いるRNA-FISHによって核内RNA一次転写産物を検出し、非同調的複製をするDiGeorge Syndrome(DGS)責任領域のクローンがbiallelicに発現していることを明らかにした。また、セントロメアへテロクロマチン領域の低アセチル化状態の維持機構として、別の場所で脱アセチル化されたヒストンが、セントロメア領域に輸送されるという機構の存在を示した。

Research Products

• [Publications] Chee-Gun Lee: "Molecular Analysis of the cDNA and Genomic DNA Encoding Mouse RNA Helicase A" Genomics. 47巻. 365-371 (1998)
• [Publications] Sachiko Kitanaka: "Inactivating Mutations in the 25-Hydroxyvitamin D3 1α-Hydroxylase gene in Patients with Pseudovitamin D-Deficiency Rickets" New England Journal of Medicine. 338巻. 653-661 (1998)
• [Publications] Katsuzumi Okumura: "Temporal Order of DNA Replication of Imprinted IGF2 Gene and Non-imprinted TNF and RFC5 Genes in Human Lymphocytes" Bulletin of the Faculty of Bioresources Mie University. 20号. 47-54 (1998)
• [Publications] Yasushi Taniguchi: "Nucleotide Sequence of the Ring3 Gene in the Class II Region of the Mouse MHC and Its Abundant Expression in Testicular Germ Cells" Genomics. 51巻. 114-123 (1998)
• [Publications] Toshihiko Eki: "Assignment of the Human Homologue of the Yeast Origin Recognition Complex Subunit ORC4 to Human Chromosome Band 2q22-q23 by in situ Hybridization and Somatic Cell Hybrid Analysis" Cytogenetics and Cell Genetics. 81巻. 89-90 (1998)
• [Publications] Noriyuki Yanaka: "Expression,Structure and Chromosomal Localization of the Human cGMP-binding cGMP-specific Phosphodiesterase Gene(PDE5A)" European Journal of Biochemistry. 25巻. 391-399 (1998)
• [Publications] Takashi Shiina: "Physical Mapping between the S and HLA-E Genes in the Human MHC Class I Region: Construction of a BAC,PAC and Cosmid Contig" Immunogenetics. 48巻. 402-407 (1998)
• [Publications] Katsuzumi Okumura: "Chromosomal Localization of Human DNA-binding Nuclear Protein(NP220)to 2p13.1-p13.2 by Fluorescence in situ Hybridization" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 62巻. 1640-1642 (1998)
• [Publications] Shin Ogata: "Apoptosis Induced by Niacin-related Compounds in HL-60 Cells" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 62巻. 2351-2356 (1998)
• [Publications] Takeshi Uchiumi: "Isolation of a Novel Human Canalicular Multispecific Organic Anion Transporter,cMOAT2/MRP3 and Its Expression in Cisplatin Resistant Cancer Cells with Decreased ATP-dependent Drug Transport" Biochemical Biophysical Research Communications. 252巻. 103-110 (1998)
• [Publications] Shin Ogata: "Effects of Poly(ADP-ribose)polymerase Inhibitors and NAD on the Apoptosis Induced by Actinomycin D in Human Leukemia Cells HL-60" Bulletin of the Faculty of Bioresources Mie University. (印刷中).
• [Publications] Masato Tsurudome: "Primary Structure of the Light Chain of FRP-1/CD98/4F2 Predicts a Protein with 11 Transmembrane Domains" Journal of Immunology. (印刷中).