1998 Fiscal Year Annual Research Report

蛍光プローブによるCa^<2+>放出チャネルタンパク質の機能分担の解明

Research Project

Project/Area Number	10169256
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	村山尚順天堂大学, 医学部, 講師 (10230012)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小川靖男順天堂大学, 医学部, 教授 (50103841)
Keywords	カルシウムチャネル / 蛍光プローブ / リアノジン受容体 / イノシトール3リン酸受容体
Research Abstract	細胞内Ca^<2+>ストアは筋収縮や神経伝達,脳の高次機能といった様々な細胞機能に重要な役割を果たしていることが明らかになっている.本研究では細胞内Ca^<2+>ストアに存在するCa^<2+>放出チャネルであるイノシトール3リン酸受容体(IP3R)およびリアノジン受容体(RyR)を生きた細胞内で可視化しその細胞内局在を調べ,細胞内Ca^<2+>濃度変化との同時測定によりこれらのCa^<2+>放出チャネルの役割を明らかにすることを試みた. 可視化の方法としてはそれぞれのタンパク質に対する特異的な抗体を作製し,これに蛍光プローブをつけて細胞内に導入することとした.本年度はこの実験の最初の段階である特異的な抗体の作製と蛍光プローブ標識を行った.抗体はIP3RおよびRyRの一次構造の比較から特異的な部位を選んでその部分配列をペプチド合成し,これをウサギに免疫してポリクローナル抗体として得た.現在までにRyRに対しては全てのサブタイプを認識するものおよび各サブタイプ(RyR1-3)特異的な抗体がそれぞれ得られている.これらの抗体は精製後,励起波長の異なる蛍光色素(Cy2,Cy3,Cy5)でそれぞれ標識した。ウエスタンブロットおよび蛍光抗体法により蛍光標識が良好に導入されたことが確認された. 同時に,抗体遺伝子をSigle chain Fv fragmentとして細胞内に発現させることも試みた.可視化の方法としてはクラゲの蛍光タンパク質であるgreen fluorescent protein(GFP)との融合タンパク質として発現させる方法を用いた.RyRに対するポリクローナル抗体が作製されたアミノ酸配列をマウスに免疫し,これらマウスのB細胞のcDNAライブラリよりスクリーニングを行った.現在までに一次スクリーニングでそれぞれ数個のポジティブなクローンが得られておりさらにクローニングを進めている段階である.

Research Products

(8 results)

All Other

All Publications (8 results)

[Publications] Murayama,T.: "Stimulation by polyols of the two ryanodine receptor isoforms of frog skeletal muscle" Journal of Muscle Research and Cell Motility. 19. 15-24 (1998)
[Publications] 村山尚: "cADPR/Ryanoid-ICR" 生体の科学. 49. 424-426 (1998)
[Publications] Murayama,T.: "Effects of caffeine and Mg^<2+> on the Ca^<2+> activation and inactivation sites of frog ryanodine receptor" Biophysical Journal. 74. A163 (1998)
[Publications] Murayama,T.: "Effects of caffeine and Mg^<2+> on the Ca^<2+> activation and inactivation sites of ryanodine receptor" Japanese Journal of Pharmacology. 76. 201P (1998)
[Publications] 村山尚: "特異的抗体による哺乳類横隔膜の3型リアノジン受容体(RyR3)の精製およびその性質の検討" 日本薬理学雑誌. 112. 65P (1998)
[Publications] Ogawa,Y: "Comparison of properties of Ca^<2+> release channels between rabbit and frog skeletal muscles" Molecular and Cellular Biochemistry. (in press). (1999)
[Publications] Ogawa,Y.: "Characteristics of ryanodine receptor type 3 isoform (RyR3) and its homologues in The Structure and Function of Ryanodine Receptors" Edited by A.Williams and R.Sitsapesan.Imperial College Press,London,UK, 5-22 (1998)
[Publications] 村山尚: "続心臓代謝実験法,II受容体に関する実験 (Ryanodine receptor)" 六法出版社,東京, 101-107 (1998)

1998 Fiscal Year Annual Research Report

蛍光プローブによるCa^<2+>放出チャネルタンパク質の機能分担の解明

Principal Investigator

村山 尚 順天堂大学, 医学部, 講師 (10230012)

Research Products

[Publications] Murayama,T.: "Stimulation by polyols of the two ryanodine receptor isoforms of frog skeletal muscle" Journal of Muscle Research and Cell Motility. 19. 15-24 (1998)

[Publications] 村山 尚: "cADPR/Ryanoid-ICR" 生体の科学. 49. 424-426 (1998)

[Publications] Murayama,T.: "Effects of caffeine and Mg^<2+> on the Ca^<2+> activation and inactivation sites of frog ryanodine receptor" Biophysical Journal. 74. A163 (1998)

[Publications] Murayama,T.: "Effects of caffeine and Mg^<2+> on the Ca^<2+> activation and inactivation sites of ryanodine receptor" Japanese Journal of Pharmacology. 76. 201P (1998)

[Publications] 村山 尚: "特異的抗体による哺乳類横隔膜の3型リアノジン受容体(RyR3)の精製およびその性質の検討" 日本薬理学雑誌. 112. 65P (1998)

[Publications] Ogawa,Y: "Comparison of properties of Ca^<2+> release channels between rabbit and frog skeletal muscles" Molecular and Cellular Biochemistry. (in press). (1999)

[Publications] Ogawa,Y.: "Characteristics of ryanodine receptor type 3 isoform (RyR3) and its homologues in The Structure and Function of Ryanodine Receptors" Edited by A.Williams and R.Sitsapesan.Imperial College Press,London,UK, 5-22 (1998)

[Publications] 村山 尚: "続心臓代謝実験法,II受容体に関する実験 (Ryanodine receptor)" 六法出版社,東京, 101-107 (1998)

村山尚順天堂大学, 医学部, 講師 (10230012)

[Publications] 村山尚: "cADPR/Ryanoid-ICR" 生体の科学. 49. 424-426 (1998)

[Publications] 村山尚: "特異的抗体による哺乳類横隔膜の3型リアノジン受容体(RyR3)の精製およびその性質の検討" 日本薬理学雑誌. 112. 65P (1998)

[Publications] 村山尚: "続心臓代謝実験法,II受容体に関する実験 (Ryanodine receptor)" 六法出版社,東京, 101-107 (1998)