RNAポリメラーゼIIと相互作用をもつ蛋白質因子の単離とその機能の解析

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10173225
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 木村 誠 国立遺伝学研究所, 分子遺伝研究系, 助手 (00290891)
• Keywords: RNAポリメラーゼII / 転写調節 / 蛋白質相互作用 / 分裂酵母

Research Abstract

RNAポリメラーゼII(PolII)は、12種のサブユニット蛋白質で構成される。このうち、分裂酵母での遺伝子クローニングが遅れていたRpb4、Rpb9の2つのサブユニットの遺伝子をクローニングし、12種全ての遺伝子の単離を完了した。これらの遺伝子を用いて、サブユニット蛋白質にGST、ヘマグルチニン、ヒスチヂンクラスター等のタグを導入した分裂酵母株を作製した。これらの酵母株を大量培養し、タグに対するアフィニティーを利用した生化学的方法で、タグ導入サブユニットまたはそれを含むPolIIと複合体を形成する蛋白質の単離条件を検討中である。
また、PolIIの本体構造についての解析を行い、以下の結果を得ている。
精製PolIIを架橋試薬で処理し、ウェスタン法でサブユニット間架橋体を同定する方法と、組換えサブユニット蛋白質を用いたファーウェスタン法による解析で、サブユニット間相互作用の全体像をほぼ決定した。小型サブユニットは、それぞれ、Rpb1、Rpb2の二つの大型サブユニットの一方または両方と相互作用をもち、小型サブユニット間の相互作用は、Rpb3-Rpb10、RPb3-Rpb11、Rpb5-Rpb6、Rpb6-Rpb7、Rpb6-Rpb8の間で検出された。
また、試験官内で構成した伸長複合体のRNA3'末端に光反応性のUTP誘導体を導入し、伸長途中のRNAをPolIIに架橋して、活性中心を構成するサブユニットを特定した。活性中心はRpb1、Rpb2の二つのサブユニットにより構成される。さらに、架橋後これらのサブユニットを単離し、酵素で限定分解することにより、アミノ酸番号でRpb1の509-917、Rpb2の306-530、934-994の領域が活性中心の近傍に存在することを示した。

Research Products

• [Publications] Akira Ishiguro: "Two large subunits of the fission yeast RNA polynerase II provide platforms for the assembly of small subunits" Journal of Molecular Biology. 279. 703-712 (1998)
• [Publications] Hitomi Sakurai: "Identification of the gene and the protein of RNA polymerase II subunit 9(Rpb9)from the fission yeast Schizosaccharomycespombe" Gene. 221. 11-16 (1998)
• [Publications] Akira Ishihama: "Subunits of yeast RNA polymerase II:structure and function" Current Opinion in Microbiology. 1. 190-196 (1998)
• [Publications] Wjatschesslaw A.Wlassoff: "Functional organization of two large subunits of the fission yeast Schizo-saccharomycesspombe RNA polymerase II:location of the catalytic sites" Journal of Biological Chemistry. in press. (1999)