高度好熱菌DNA修復蛋白質の蛋白質間およびDNAとの相互作用の解析

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10179209
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 加藤 龍一 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (50240833)
• Keywords: DNA修復 / ミスマッチ修復 / ヌクレオチド除去修復 / 塩基除去修復 / 組換え修復 / X線結晶構造解析 / 高度好熱菌 / ドメイン構造

Research Abstract

高度好熱菌RecAについて生化学的解析を行い大腸菌RecAと比較する事によって、DNA分子の相同的組換えに熱の及ぼす効果を見出した(Kato and Kuramitsu,Eur.J.Biochem.inpress)。また、高度好熱菌RecAを用いてその蛋白質間相互作用がカオトロピックイオンによって弱められることを見出し、異なる会合状態におけるRecAの性質について調べた(Masui et al.,Biochemistry37,14788-14797)。
変性実験とプロテアーゼによる限定分解実験から、MutSは4つの構造ドメインからなると推定し、これらのドメインのうち中央部に位置するドメインが2本鎖DNAと相互作用する領域であることを示した(Tachiki et al.,Nucleic Acids Res.26,4153-4159)。また、これら構造ドメインの情報を元にして3つの断片化蛋白質を作成し、中央部のドメインが多量体形成能と2本鎖DNAへの非特異的な結合能を持つこと、及び、C末端ドメインがATP加水分解活性とミスマッチ特異的DNA結合能を持つことを示した(Tachiki et al.,in preparation)。また、溶液中でのMutSの会合状態をX線小角散乱を用いて測定した(Kato et al.,in preparation)。さらに、単独およびADP共存下でMutSの結晶化に成功した。
MutSと相互作用するUvrD,MutLの大量発現系の構築と精製法の確立を行った(Kato et al.,in preparation;Shiba et al.,inpreparation)。
UvrA,Bと傷害DNAとの相互作用を蛍光DNAを用いて定量的に解析した(Yamagata et al.,in preparation)。また、UvrB(Shibata et al.,Acta Cryst.D,in press:Nakagawa et al.,inpreraration)及びMutM(Sugahara et al.,in preparation)の結晶化を行い、現在着実にX線構造解析が進行中である。

Research Products

• [Publications] Ryuichi Kato: "Characterization of thermostable RecA protein and analysis of its interaction with single-stranded DNA" Eur.J.Biochem.(in press). (1999)
• [Publications] Tadashi Nakai: "Structure of Thermus thermophilus HB8 aspartate aminotransferase and its complex with malate" Biochemistry. (in press). (1999)
• [Publications] Akihiro Shibata: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a DNA excision repair enzyme,UvrB.from Thermus thermophilus HB8" Acta Cryst.,Sec.D. (in press). (1999)
• [Publications] Ryoji Masui: "Characterization of the oligomeric states of RecA protein: monomeric RecA protein can form a nucleoplotein filament" Biochemistry. 37. 14788-14797 (1998)
• [Publications] Yuko Nobe: "The novel substrate recognition mechanism utilized by aspartete aminotransferase of the extreme thermophile Thermus thermophilus HB8" J.Biol.Chem.273. 29554-29564 (1998)
• [Publications] Tadashi Nakai: "Crystallization and preliminary X-ray characterization of aspartate aminotransferase from an extreme thermophile,Thermus thermophilus HB8" Acta Cryst.,Sec.D. 54. 1032-1034 (1998)
• [Publications] Hidehisa Tachiki: "Domain Organization and functional analysis of Thermus thermophilus MutS protein" Nucleic Acids Res.26. 4153-4159 (1998)
• [Publications] Tsutomu Mikawa: "Thermostable repair enzyme for oxidative DNA damage from extremely thermophilic bacterium,Thermus thermophilus HB8" Nucleic Acids Res.26. 903-910 (1998)
• [Publications] 中川紀子: "原核生物のヌクレオチド除去修復" 実験医学. 16巻. 1069-1075 (1998)