エンドサイトーシス初期過程におけるダイナミンGTPaseの機能の解明

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10215202
• Research Institution: 山梨医科大学
• Principal Investigator: 馬場 健 山梨医科大学, 医学部, 助教授 (90208710)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 植田 秀穂 山梨医科大学, 医学部, 助手 (10242629) ; 藤井 靖久 山梨医科大学, 医学部, 助手 (60126703)
• Keywords: ダイナミン / エンドサイトーシス / クラスリン被覆ピット / コレステロール / 細胞膜 / カベオラ

Research Abstract

ダイナミンはエンドサイトーシス初期過程、特にクラスリン被覆小胞の形成を制御しているGTP結合蛋白質である。私たちはこれまでにダイナミンが被覆ピット頚部に集合するためには、ダイナミンヘのGTP結合が必須であることなどを明らかにしてきた。これらの成果をもとにした平成11年度の研究では、以下のような成果が得られた。
(1)ダイナミン機能改変細胞の作製と解析:脳型のダイナミン-1遺伝子のGTP結合領域に点変異T65Fを加え、常時活性化型変異ダイナミンの作製を試みた。T65F変異ダイナミンをHeLa細胞に導入したところ、トランスフェリンのエンドサイトーシスは正常と同様で、期待されたエンドサイトーシスの促進効果は得られなかった。しかし、電顕的観察によりクラスリン被覆ピットに大小不同が見られた。(2)ダイナミン変異細胞のリアルタイム観察:GFP-野生型ダイナミン及びGFP-K44A変異ダイナミンを導入したK562細胞を用いて、蛍光顕微鏡下でリアルタイム観察を行った。その結果、GFP-野生型ダイナミンは細胞質内及び細胞膜直下でドット状の構造をとること、さらにGFP-K44A変異ダイナミンではそれに加え、細胞質内で小胞様の構造も標識されることが明らかになった。(3)エンドサイトーシスに対する細胞膜脂質修飾の影響:細胞膜陥凹形成を阻害する合成脂質PEG-コレステロールを細胞に投与したときの、クラスリン被覆ピットの形態像およびダイナミンの局在を観察した。その結果、クラスリン被覆ピットはPEG-コレステロール処理によりその開口部が開大し、くびれを持ったピットはほとんど見られなくなった。これらの開大したクラスリン被覆ピットでは、ダイナミンのリング状の集合像は認められなかった。このことより、被覆ピット頚部があらかじめくびれていることが、ダイナミンの自己集合に必須と考えられた。

Research Products

• [Publications] Baba, Takeshi: "Immunocytochemical study of endocytotic structures accumulated in HeLa cells transformed with a temperature-sensitive mutant of dynamin"J. Histochem. Cytochem.. 47. 637-648 (1999)
• [Publications] Ueda, Hideho: "Rat optic nerve oligodendrocytes develop in the absence of viable retinal ganglion cell axons"J. Cell. Biol.. 146. 1365-1374 (1999)
• [Publications] 馬場健: "リソソームの組織化学的研究"生体の科学. 50. 78-84 (1999)
• [Publications] 馬場健: "核-細胞質間輸送と小胞輸送"羊土社. 143-148 (1999)