エンドサイトーシス初期過程におけるダイナミンGTPaseの機能の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10215202
• Research Institution: Yamanashi Medical University
• Principal Investigator: 馬場 健 山梨医科大学, 医学部, 助教授 (90208710)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹居 孝二 岡山大学, 医学部, 教授 (40322226) ; 藤井 靖久 山梨医科大学, 医学部, 助手 (60126703)
• Keywords: エンドサイトーシス / ダイナミン / クラスリン / アデノウイルスベクター / リポソーム / PIP2

Research Abstract

ダイナミンは100kDのGTP結合蛋白質で、我々はこれまでに、種々の変異ダイナミン導入細胞およびシナプス小胞の試験管内再構成法を用いた検討を行ってきた。本年度に得られた成果は以下の通りである。
(1)変異ダイナミン導入細胞を用いた形態学的および生化学的検討 これまでに私達が作成したGTP結合性変異ダイナミン、K44A, S45N, T65PのGTP結合性を生化学的に詳細に検討したところ、いずれも同様にGTP, GDP結合性が欠損しており、3者の違いは生化学的には鑑別できなかった。しかし形態学的には、それぞれ異なった形態の中間構造体を持つことが明らかになり、これらの変異ダイナミンのGTP結合性以外の性質が、クラスリン被覆ピット形成の異なる段階で阻害効果を発揮していることが示唆された。
(2)ライセニンの超微形態学的検討 スフィンゴミエリンに特特異的に結合するペプチド、ライセニンの細胞膜上での形態を検討した。スフィンゴミエリンをふくむリポソームにライセニンを加えると、偵径10nmの均一な六角柱状のオリゴマーが形成された。赤血球にライセニンを加えると同様なオリゴマーが細胞膜上に形成され、溶血が誘導された。今後、種々の培養細胞を用いて、ライセニンのエンドサイトーシスおよびダイナミン機能に対する影響を検討する予定である。
(3)シナプス小胞の試験管内再構成の検討 種々の脂質組成でリポソームを調整し、脳組織より抽出した細胞質成分およびATP、GTPγSを加えることで、試験管内でシナプス小胞類似の小胞形成を誘導ことができた。小胞形成に対する膜脂質組成の影響を検討したところ、PIP2を加えると、小胞形成が促進されることが明らかになった。PIP2は速やかに分解されたが、小胞形成の促進は持続していた。これらよりPIP2は膜に被覆構成タンパク質をリクルートすることが示唆された。

Research Products

• [Publications] Lamaze C, Dujeancourt A, Baba T, Lo CG, Benmerah A, Dautry-Varsat A: "Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway"Molecular Cell. 7. 661-671 (2001)
• [Publications] Ueda H, Ueda K, Baba T, Ohno S: "d-and g-Sarcoglycan localization in the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle"J Histochem Cytochem. 49. 529-538 (2001)
• [Publications] Serizawa Y, Ueda H, Baba T, Ueno A, Takeda M, Ohno S: "Intravesicular Fas localization in epithelial cells of castrated rat prostate glands"Histol Histopathol. 16. 453-462 (2001)
• [Publications] Baba T, Rauch C, Xue M, Terada N, Fujii Y, Ueda H, Takayama I, Ohno S, Farge F, Sato SB: "Clathrin-dependent and clathrin-independent endocytosis are defferentially sensitive to insertion of poly(ethylene glycol-derivatized cholesterol in the plasma membrane"Traffic. 2. 501-512 (2001)
• [Publications] Damke H, Binns DD, Ueda H, Schmid SL, Baba T: "Dynamin GTPase domain mutants block endocytic vesicle formation at morphologically distinet stages"Mol Biol Cell. 12. 2578-2589 (2001)
• [Publications] Kinuta M, Yamada H, Abe T, Watanabe M, LiSA, Kamitani A, Yasuda T, Matsukawa T, Kumon H, Takei K: "Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphhate stimulates vesicle formation from liposomes by brain cytosol"Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 99. 2842-2847 (2002)