動物細胞小胞輸送変異株とセミインタクト細胞を用いたサイトーシスの分子機構の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10215209
• Research Institution: Okazaki National Institute, Center for Integrative Bioscience
• Principal Investigator: 村田 昌之 岡崎国立共同研究機構, 統合バイオサイエンスセンター, 助教授 (50212254)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大橋 正人 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助手 (90290915)
• Keywords: エンドサイトーシス / エキソサイトーシス / エンドソーム・リソソーム / ゴルジ体 / 小胞体 / GFP / セミインタクト細胞 / 細胞周期

Research Abstract

エンドサイトーシス後期過程に異常のあるCHO変異株群を樹立し、解析を進めている。本年度は、変異株のひとつ、LEX2株で、コレステロール生合成の後期過程に関わる酵素のひとつに異常があることにより、細胞内遊離コレステロールレベルが低下し、後期エンドソームでの分子選別に異常が生じていることを突き止めた。そして、(1)後期エンドソーム多胞体からのゴルジ方向への分子選別にコレステロールが必須であること、(2)この分子選別過程に、多胞体構造の再構築が重要な役割をもつと考えられること、を示した。また、エキソサイトーシス経路の分子メカニズム解明を目的とし、「GFP可視化技術」と形質膜を一部透過性にした「セミインタクト細胞系」をカップルさせた顕微測光アッセイシステム確立した。本年度は、本システムを用い光学顕微鏡下の単一細胞内でGFP融合タンパク質の輸送及びGFP標識オルガネラのダイナミクスを定量的に解析し、かつ生化学的に関連因子を探索し次の結果を得た。(1)細胞分裂期(M期)におけるCHO細胞のゴルジ体、小胞体(ER)の形態変化と両オルガネラ間の小胞輸送ダイナミクスが密接に関係していることを発見した。(2)M期初期では、ER→ゴルジ体間の順行輸送がcdc2キナーゼ依存的に停止するが、逆行輸送はむしろ活性化されることが判った。(3)この原因の一つとしてtransitional ER(tER:ERからゴルジ体へ向かう輸送小胞が出芽するプラットフォーム)の形成がcdc2キナーゼ依存的に破壊されることを生細胞、セミインタクト細胞系を用いて明らかにした。M期において、このtERの形成が阻害されることによって、順行輸送は停止し、逆行輸送は活性化される結果、M期初期にはゴルジ体の一部がERへ吸収されM期ゴルジ体が消失することを明らかにした。

Research Products

• [Publications] Tsuyoshi Hirota: "Effect of brefeldin A on melatonin secretion of chick pineal cells"Journal of Biochemistry. 129. 51-59 (2001)
• [Publications] 加納ふみ: "細胞内イベントを操作するセミインタクト細胞系-新しいナノテクノロジーの基盤デバイスとして"生体の科学. 52. 340-346 (2001)
• [Publications] 田中亜路: "哺乳動物細胞オルガネラの細胞周期依存的ダイナミクス"生物物理. (印刷中). (2002)
• [Publications] 加納ふみ: "細胞内小胞輸送ネットワークの可視化解析"実験医学. (印刷中). (2002)
• [Publications] 村田昌之: "膜動輸送:細胞内トラッフィク"生物物理学ハンドブック. (印刷中). (2002)
• [Publications] 石堂美和子: "分子選別ステーションとしての後期エンドソーム"蛋白質 核酸 酵素. 46. 2127-2132 (2001)
• [Publications] Miwako Ishido: "Cholesterol requirement for cation-independent mannose 6-phosphate receptor exit from multivesicular late endosomes to the Golgi"Journal of Cell Science. 114. 1665-1676 (2001)