DNAの切断と再結合におけるhelicase遺伝子familyの機能解析

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10216204
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 近藤 直実 岐阜大学, 医学部, 教授 (50124714)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金子 英雄 岐阜大学, 医学部, 助手 (80293554)
• Keywords: BLM / Bloom症候群 / ヘリカーゼ / DNA修復 / DNA切断

Research Abstract

本研究の目的は、DNAの切断と再結合におけるhelicase遺伝子family、特にBLMの機能と構造を多角的に解析し、至っては発癌老化の機序にも迫るものである.
平成10年度には下記の点が進められた.
(1) BLMヘリカーゼ領域の大量発現: BLMのヘリカーゼ領域をGSTベクターに組み込み大腸菌に大量発現させた.Glutathione-Sepharose4Bで融合タンパクを回収後、トロンビンできりだしBLMのへリカーゼ領域のみを回収することができた.
(2) ヘリカーゼ活性の測定: ^<32>pでラベルしたoligo DNAをM13のベクターにannealingさせ基質とした.この基質とBLMヘリカーゼ領域をATPの存在下、または非存在下で反応させた.融合タンパクはATPの存在下でのみヘリカーゼ活性を示した.
(3) BLMの核移行シグナルの解析: BLMの遺伝子とGreen fluoreseent protein(GFP)の融合タンパクをHeLa細胞に発現させ、細胞内の局在を観察した.BLMのC-末に2つの塩基性アミノ酸クラスターが存在しBLMの核移行シグナルとして機能することを明かにした.さらに、この部位に変異を導入し核局在の有無を観察したところ、遠位のアミノ酸のKRRが重要であることが明かになった.さらに、マウスBLMも同様にC-末に核移行シグナル有することを明かにした.
(4) 症例の解析: Fanconi貧血と診断されていた症例のBLMに1610insAというnon sense変異を検出した.BLMには非定型例も存在すると考えられ遺伝子解析による診断が重要である。
(5) BLMと相互作用するタンパクの解析: Two-hybrid systemを用いてBLMと相互作用するタンパクのクローニングを行い数個の陽性クローンを得た.現在、塩基配列を決定し既知の遺伝子との相同性を解析中である.
以上の成果をもとに次年度の研究を進める.

Research Products

• [Publications] Kondo N et al: "Cord blood lymphoeyce responses to antigens for the piediction of allergy." Pedintric Asthma Allergy & Immunology. 12. 61-66 (1998)
• [Publications] Kondo N et al: "DNase I hypersensitive sites in himan I E region of lmmunolobulin heavy chain genes abnomally induced by interleuking in B lymphocytes of atopic pattenu with high levels of scrum IgE." J Invest Allergol & Clin Immunol. 8. 234-238 (1998)
• [Publications] Kaneko H, Kondo N et al: "BLM (the causative gene of Bloom syndrome) protein translocation into the nucleus by a nuclear lacalisation signal." Biochem Biophysical Res Commun. 240. 348-353 (1997)
• [Publications] Tashita H, Kondo N et al: "Molecular basis of selective IgG2 deficiency : The mutatid membrane-bound form of γ2 heavy chain caused complete IgG2 deficiency in two Japanese siblings." J Clin Invest. 101. 677-681 (1998)
• [Publications] Fukao T, Kondo N et al: "Ataria telangiectasia in the Japanese population : identification of R1917X,W2991R,R2909G,IVS33+2T+A,and 788 dets,the latter two being relatively common mutations." Hum Mutat. 12. 338-343 (1998)
• [Publications] Kondo N et al: "Reduced interferon gamma production by antigen stimulated cord blood mononuclear cells is a risk factor of allergic disorders-6-year follow-up study." Clin Exp Allergy. 28. 1340-1344 (1998)
• [Publications] 近藤直実: "現代内科学:原発性免疫不全症候群(1)抗体不全を主とする疾患" 金芳堂, 2384 (1997)
• [Publications] 近藤直実: "分子アレルギー学:アトピーとIgE遺伝子" メディカルレビュー社, 599 (1998)