シャフロン特異的組換え酵素におけるDNAの切断と再結合

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10216207
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
• Research Institution: Tokyo Metropolitan University
• Principal Investigator: 駒野 照弥 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (00087131)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古屋 伸久 東京都立大学, 理学研究科, 助手 (50244413)
• Keywords: シャフロン / 部位特異的組換え / プラスミドR64 / 接合伝達 / DNAの切断と再結合

Research Abstract

R64シャフロンでは、4種のDNAセグメントが7個の19bp反復配列により区分されている。領域下流に位置するrci遺伝子の産物の作用により、任意の逆向き反復配列間で部位特異的組換え反応が起き、各セグメントは単独あるいは連合して逆位を行う。本領域は、PilVタンパクをN末端部が一定でC末端部が異なる7種に変換する切換えスイッチとして機能し、液内接合伝達における受容菌の特異性を決定している。本年度は、シャフロン特異的組換え酵素であるRciタンパクを精製し、精製タンパクを用いた試験管内組換え系を構築することができた。スーパーコイルDNAのみを基質として用い、リラックスまたは直鎖状DNAは基質として利用できなかった。精製Rciタンパクと基質DNAを反応させると、19bp反復配列の一端に7bpの5′突出粘着末端を生成させるようなニックの導入が観察され、この部位でDNA鎖の交換が行われると推定された。精製タンパクは、19bp反復配列およびその上流約15bpに配列特異的および非特異的に結合した。19bp反復配列に変異を導入し、さらにその上流配列を変化させて組換え活性を調べた結果、19bp反復配列のみならず上流配列も組換えに大きな影響を及ぼすことが明らかになった。また19bp反復配列の上流に反復配列の12bp相当を導入して内部逆向き配列を構成させた場合には、この組換え部位を利用したDNAセグメントの脱離も認められた。Rciタンパクの19bp反復配列に対する非対称的認識が、シャフロンにおける順向き反復配列間での組換えを阻止する原因となっていると推定された。

Research Products

• [Publications] Gyohda et al.: "Analysis of DNA inversions in the shufflon of Plasmid R64." Journal of Bacteriology. 179. 1867-1871 (1997)
• [Publications] Kim and Komano: "The plasmid R64 thin pilus identified as a type IV pilus." Journal of Bacteriology. 179. 3594-3603 (1997)
• [Publications] Horiuchi and Komano: "Mutational analysis of plasmid R64 thin pilus prepilin : the entire prepilin sequence is required for processing by type IV prepilin peptidase." Journal of Bacteriology. 180. 4613-4620 (1998)
• [Publications] H.Sekimoto et al.: "Molecular clonig and Characterization of aldehyde oxidase in Arabidopsis thaliana." Plant and Cell Physiology. 39. 433-442 (1998)
• [Publications] T.Yoshida et al.: "Purification and characterization of thin pili of lncll plasmids Collb-P9 and R64:formation of PilV-specific cell aggregates by type IV pili." Journal of Bacteriology. 180. 2842-2848 (1998)
• [Publications] T.Yoshida et al.: "Twelve pil genes are required for the biogenesis of R64 thin pilus." Journal of Bacteriology. 181 in press. (1999)