ペルオキシソーム膜ABCタンパク質の構造・機能と遺伝病

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10217203
• Research Institution: Toyama Medical and Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 今中 常雄 富山医科薬科大学, 薬学部, 教授 (50119559)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宇根 瑞穂 広島大学, 医学部, 助手 (20144826) ; 守田 雅志 富山医科薬科大学, 薬学部, 助手 (20191033) ; 岡村 昭治 富山医科薬科大学, 薬学部, 助教授 (60019122) ; 古谷 博和 九州大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (60253415)
• Keywords: ABCタンパク質 / トランスポーター / ペルオキシソーム / 副腎脳白質ジストロフィー / 脂肪酸代謝 / オルガネラ局在化 / Pex19p / 昆虫細胞発現系

Research Abstract

ペルオキシソーム膜上の4種のABCタンパク質についての解析を行い、以下の知見を得た。
1.PMP70のヌクレオチドによる構造変化を、ラット肝ペルオキシソームを用い、各種ヌクレオチド存在下、トリプシン抵抗性を指標として検討した。その結果、PMP70はATP結合によりhelicalドメインが、ADP結合によりヌクレオチド結合ドメインが構造変化することが明らかになった。基質輸送の相関から興味深い。
2.PMP70、ALDPのリン酸化をラット肝ペルオキシソームを用い、[γ-^<32>P]ATPとincubation後、免疫沈降より解析した。その結果、PMP70、ALDPがリン酸化されることが明らかになった。このリン酸化は、tyrosine kinase阻害薬lavendustin Aにより阻害された。一方、protein kinase A、protein kinase C、casein kinase阻害薬では全く阻害されなかった。またリン酸化条件下、ペルオキシソーム膜上でPMP70とALDPの複合体が形成される可能性が示唆された。
3.各種部位欠損PMP70とGFPとの融合タンパク質をCHO細胞に発現させ、PMP70のペルオキシソーム膜局在化シグナルを共焦点レーザー顕微鏡で検討した。その結果、PMP70の第2膜貫通ドメインとそのN末端側に存在する塩基性アミノ酸クラスターがペルオキシソーム膜局在化に必要であることが示唆された。さらにPMP70がペルオキシソーム移行可能なコンフォーメーションを維持するために、N末端から60番目までの領域と第6膜貫通ドメインが必要であることが示唆された。
4.PMP70の局在化に関与するペルオキシソーム形成因子Pex19Pを大腸菌を用い大量精製した。現在結晶化可能な状況となっている。さらにin vitro発現系により合成したPMP70を精製Pex19P共存下で結晶化することも試みている。ABCタンパク質局在化過程のモデルを構築したい。
5.昆虫細胞発現系を用いPMP70、ALDP、ALDRPを大量精製した。それぞれにヌクレオチド結合性に差があることが示された。さらに各ABCタンパク質の特性を解析中である。
次年度、ペルオキシソームABCタンパク質の局在化機構、ペルオキシソーム膜での存在状態の制御、タンパク質の機能ならびに疾患との関わりをまとめる予定である。

Research Products

• [Publications] Nakagawa, M.et al.: "Urinary bile alcohol profiles in healthy and cholestatic children"Clin.Chim.Acta. 314・1-2. 101-106 (2001)
• [Publications] Ito, R.et al.: "Temperature-sensitive phenotype of chinese hamster ovary cells defective in pex5 gene"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 288・2. 321-327 (2001)
• [Publications] Hashiguchi, N.et al.: "Peroxisomes are formed from complex membrane structures in PEX6-deficient CHO cells upon genetic complementation"Mol.Biol.Cell. 13・2. 711-722 (2002)
• [Publications] Kashiwayama, Y.et al.: "Nucleotide-induced conformational changes of PMP7O, an ATP binding cassette transporter on rat liver peroxisomal membranes"Biochem.Biophys.Res.Commun.. (in press). (2002)
• [Publications] Hung, Y.et al.: "Intermediate state of 3-ketoacyl-CoA thiolase in the Peroxisomal import process"Biochim.Biophys.Acta. (in press). (2002)