1999 Fiscal Year Annual Research Report
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10358015
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
海老塚 豊 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (90107384)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
嶋田 寿男 日本ロシェ研究所, 主席研究員
藤井 勲 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教授 (70181302)
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| Keywords | 生合成遺伝子 / サポニン / トリテルペン合成酵素 / オキシドスクワレン / 抗生物質 / 放線菌 / エンジイン / 耐性 |
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| Research Abstract |
(1)トリテルペンサポニン大量生産系の開発
各種トリテルペン生産植物からPCR法により、約30種のオキシドスクワレン閉環酵素全長cDNAを取得した。これら全長cDNAを酵母発現用プラスミドに組み込み、ラノステロール合成酵素欠損株の酵母を形質転換し酵素機能の同定を行った。その結果、生成物特異性の異なる4種のトリテルペン合成酵素cDNA、すなわちβ-アミリン合成酵素、ルペオール合成酵素、α-アミリン合成酵素、ククルビタジエノール合成酵素を取得した。β-アミリン合成酵素とルペオール合成酵素のキメラ体や部位特異的変異導入体を作成し、生成物特異性に関与するアミノ酸残基を同定した。ルペオール合成酵素のアンチセンスDNAを植物形質転換用プラスミドに組み込みシロイヌナズナを形質転換した。形質転換体のT2世代における表現系を解析し、ルペオール含量の減少を確認した。
(2)新規エンジイン型抗腫瘍抗生物質生産系の開発
エンジイン構造の生合成機構を明らかにするため、ダイネミシンA生産菌である希少放射菌Micromonosporachersinaよりクローンングしたポリケタイド生合成遺伝子クラスターの解析を進め、縮合酵素、鎖長決定因子の下流約20kbの塩基配列の決定、ORFの同定を行った。また、ダイネミシンとは異なるエンジイン構造を有するネオカルチノスタチンについても、その生産菌Stereptomcyces carzinostaticusのゲノムDNAコスミドライブラリーを構築し、既知タイプI型ポリケタイド合成酵素の保存領域からデザインしたプライマーで増幅した領域をプローブとしてスクリーニングし、陽性クローンの取得に成功した。現在、その塩基配列の決定、ORFの同定を進めている。また、DNA認識部位としてのアントラサイクリノン構造の生合成遺伝子として、先にクローニングしたStereptomcyces galilaeusのアクラビノン生合成遺伝子クラスターを構成するORFのほぼ全容を明らかにした。
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[Publications] T. Kushiro: "Chimeric triterpene systhase, A possible model for multifunctional triterpene synthase"J. Am. Chem, Soc.. 121. 1208-1216 (1999)
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[Publications] T. Kushiro: "Cryptic gegiospeaficity in deprotonation step of triterpene biosynthesis catilysed by nero members of lupeol synthase"Tetrahedron Lett.. 40. 5553-5556 (1999)
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[Publications] N. Funa: "A new pathway for polyketide synthesis in microorganisms"Nature. 400. 897-899 (1999)
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[Publications] S. You: "Molecular cloning and sequencing of an Allium macrostemon cDNA profably encoding oxidosqualene cyclase"Plant Biotechnology. 16. 311-314 (1999)
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[Publications] M. Shibuya: "Two branches of the lupeol synthase gene in the molecular ebolntron of plant oxidosqualene cyclase"Eur. J. Biochem.. 266. 302-307 (1999)
