培養環境が不定胚形成に及ぼす影響の共焦点レーザー顕微鏡による観察

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10460114
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 蔵田 憲次 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (90161736)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荊木 康臣 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (50242160) ; 富士原 和宏 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (30211535)
• Keywords: 不定胚 / ニンジン / 共焦点レーザ顕微鏡 / レーシオイメージング法 / fluo-3 / Fura Red

Research Abstract

初年度は、植物細胞あるいは不定胚内のカルシウムイオン濃度分布を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する方法の確立を目的とした。既存の研究に、1プローブを用いた観察で、不定胚表面付近で濃度が高いという報告がある。しかし、プローブの分布の不均一性、蛍光の細胞塊・不定胚内での減衰などの問題があり、この結果の真偽には疑問が残る。プローブ分布の不均一性、蛍光の減衰などの影響を排除するために、レーシオイメージング法を試みた。アルゴンレーザー(488nm)によって、蛍光が励起されるfluo-3とFura Redを蛍光プローブとした。前者はカルシウムイオン濃度が高くなるほど515nm付近の波長で強い蛍光を発し、後者はイオン濃度が高くなるほど640nm付近の蛍光が弱くなる。したがって、両波長での蛍光の比はカルシウムイオン濃度に対応する。既存の研究のもう1つの問題点として、キャリブレーションができていないことを指摘できる。そこで、本研究では、ニンジンのプロトプラストを用いたin vivoキャリーブレーションをした。
ニンジン不定胚誘導直後の細胞塊から10日までの不定胚を観察した。それ以降の不定胚は大きくなりすぎて、蛍光の減衰が激しく、レーシオイメージング法でも観察不可能であった。次の現象が観察された。細胞魂あるいは不定胚は細胞内カルシウム濃度分布の観点から3つに分類できる。1つは、ほとんどすべての細胞で、細胞壁付近に高いカルシウムイオン濃度が観察され、細胞の内側は低いグループである(グループA)。2つ目は一部の細胞はグループAと同様であるが、その他の細胞では、均一にカルシウムイオン濃度が高いグループである(グループB)。3つ目は、全ての細胞が均一に高い濃度を示すものである(グループC)。不定胚誘導開始からの日数の進行とともに、グループAの比率が減少し、グループCの比率が増加した。