2000 Fiscal Year Annual Research Report
培養環境が不定胚形成に及ぼす影響の共焦点レーザー顕微鏡による観察
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10460114
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
蔵田 憲次 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (90161736)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荊木 康臣 山口大学, 農学部, 助教授 (50242160)
富士原 和宏 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (30211535)
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| Keywords | 不定胚 / ニンジン / 共焦点レーザー顕微鏡 / レーシオイメージング / fluo-3 / Fura Red |
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| Research Abstract |
不定胚形成過程でのカルシウムイオンの分布の変化を観察するために、昨年度までに、様々な試みを行い、キャリブレーション法を含めて検討してきた。蛍光プローブとして、fluo-3とFura Redを用い、両者の蛍光の比からカルシウムイオン濃度を算定するレーシオイメージング法を採用した。昨年度までの結果では、観察されたレーシオがキャリブレーションで得られたレーシオの範囲を超え、結果に不確定性が残った。そこで、本年度はキャリブレーション法に改良を加え、不定胚形成過程でのカルシウムイオン濃度分布を観察した。
キャリブレーションは、in vivoで行うことを基本とし、カルシウムイオン透過担体を用いて、培地の濃度と細胞内濃度を同じにして行う。昨年度までは、観察ごとにレーシオの値が0.2前後ずれるという問題があった。本年度は、透過担体の濃度を10μMから100μMにあげることによって、そのブレを解消でき、同時に、観察されたレーシオがキャリブレーションの範囲を大きく逸脱することもなくなった。
不定胚形成過程でのカルシウムイオン濃度の観察では、以下の結果が得られた。
1.昨年度までに観察された不定胚内のカルシウムイオン濃度の分布は今回は見られなかった。
2.レーシオのヒストグラムは次のような得意な時間的変化を示した。すなわち、不定胚誘導開始からレーシオは減少し(カルシウムイオン濃度は減少し)、3日後に最低値を記録したあと、急に増加し、4日目には誘導前の値を超えた。
この現象は本年度初めて観察されたものであり、今後、追実験で再確認する予定である。
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