緑膿菌のマルチコンポーネント型排出システムの作動機構とその分子構造の解明

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10470070
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 後藤 直正 京都薬科大学, 薬学部, 助教授 (30121560)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 辻元 秀人 京都薬科大学, 薬学部, 助手 (10257777) ; 津田 雅孝 東北大学, 遺伝生態研究センター, 教授 (90172022) ; 西野 武志 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (50097838)
• Keywords: 緑膿菌 / 異物排出 / トポロジー / DNAシャフリング / 免疫沈降 / キメラ / 膜蛋白質

Research Abstract

マルチコンポーネント型のRNDファミリー排出システムの作動機構と分子構造の解明のために,本年度は申請書の計画通り行い,下記の知見を得た.
1) 既に作成した抗体を用いた免疫沈降実験系の確立し,各コンポーネント間の相互作用を解析した.その結果,内膜コンポーネントとペリプラスムコンポーネントは常に結合した状態で存在すること,そして外膜コンポーネントには,他のコンポーネントと結合している分子と,結合せず外膜中に遊離している分子とが存在することが分かった.この結合型分子の存在は,マルチコンポーネント型の排出システムの機能発現を調べる上に大きなヒントとなる可能性を含んでいる.
2) 内膜コンポーネントのトポロジーの解析をさらに行い,本蛋白質が予想通り膜12回貫通型で,アミノ酸300個からなる巨大なループ構造を分子内に二個持つことを明らかにした.また,欠失変異体を作成することにより行った実験で,このループの内の一つが機能発現に必須のものであることが分かった.次年度はこのループの機能を本年度の研究により確立した上記1)の方法を用いて解析することを計画している.
3) 基質特異性の異なるポンプをコードする遺伝子間のDNA shufflingにより,基質特性の異なった変異体を作成する方法を確立した.次年度は,基質特異性の異なるポンプ蛋白質とのキメラ体の作成を進めて行きたい.
また,4)鉄イオンは,細菌細胞の生理維持に必須である.この代謝過程で作られた産物の細胞外輸送に本排出システムが関与することが示唆される.そこで,1)-3)の研究を進めると共に,緑膿菌における鉄代謝の遺伝学的解析を行い,鉄代謝に関与する幾つかの遺伝子を同定した.このクローン化した遺伝子と排出システムの発現を明らかにすることを計画している.

Research Products

• [Publications] Ramakrishnan Srikumar: "Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-Oprj in Escherichia coli." Antimicrob.Agents Chemother.42. 65-71 (1998)
• [Publications] 川畑敏枝: "NalB型排出蛋白質をもつ緑膿菌に対するFOMとβ-ラクタム薬の併用効果" 日本化学療法学雑誌. 46. 17-21 (1998)
• [Publications] Hiroshi Yoneyama: "Subunit swapping in the Mex-extrusion pumps in Pseudomonas aeruginosa" Biochem.Biophys.Res.Commun.244. 898-902 (1998)
• [Publications] Naomasa Gotoh: "Characterization of the MexC-MexD-OprJ multidrug efflux system in ΔmexA-mexB-oprM mutants of Pseudomonas aeruginosa." Antimicrob.Agents Chemother.42. 1938-1943 (1998)
• [Publications] Naomasa Gotoh: "Functional replacement of OprJ by OprM in the MexCD-OprJ multidrug efflux system of Pseudomonas aeruginosa." FEMS Microbiol.Lett.165. 21-27 (1998)
• [Publications] Nobuhisa Masuda: "Interplay between Chromosomal b-lactamase and the MexAB-OprM Efflux System in Intrinsic Resistance to blactans in Pseudomonas aeruginosa." Antimicrob.Agents Chemother.(in press).
• [Publications] Kiyomi Okamoto: "Molecular cloning of oprO encoding to the outer membrane protein OprE3 of Pseudomonas aeruginosa." Microbiol.Immunol.(in press).
• [Publications] Tsuda,M: "Use of a transposon-encoded site-specific resolution system for construction of large and defined deletion mutations in bacterial chromosome." Gene. 207. 33-41 (1998)
• [Publications] Takeuchi,H: "Nucleotide sequence and characterization of cdrA,a cell division-retated gene of Helicobacter pylori." J.Bacteriol.180. 5263-5268 (1998)
• [Publications] 津田雅孝: "トランスポゾン" 動生協会々報. 31. 54-55 (1998)
• [Publications] Mizote,T.: "Cloning and characterization of the thiDIJ gene of Escherichia coli encoding a thiamin-synthesizing bifunctional enzyme,hydroxymethylpyrimidine kinase/phosphomethylpyrimidine kinase." Microbiology. 145. 495-501 (1998)
• [Publications] Tsuda,M: "Mobile catabolic genes in basteria." J.Biosci.Bioeng.(in press).