炭酸固定酵素(PEPカルボキシラーゼ):遺伝子操作とX線結晶解析による機能解析

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10480157
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 泉井 桂 京都大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (20025414)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 甲斐 泰 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (40029236)
• Keywords: 炭酸固定酵素 / ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ / X線結晶解析 / タンパク質工学 / 部位特異的変異導入 / 酵素反応機構 / 大腸菌 / トウモロコシ

Research Abstract

[目的]PEPカルボキシラーゼ(以下PEPCと略)は重要な炭酸固定酵素であり、微生物および植物に広く分布する。基礎・応用の両分野から多くの注目を集めている。我々は最近PEPCの立体構造を世界で初めて解明し、ようやくタンパク工学的な研究を可能にした。本研究では、アロステリックな活性化因子および基礎PEPと結合した状態での結晶化条件の探索およびX線結晶解析を行い、さらに部位特異的変異導入による機能解析を行って炭酸固定反応機構および活性調節機構を解明する。
[研究経過および成果]1)PEPの安定なアナログであるDCDPの結合した状態でのPEPC(大腸菌)の結晶化と解析に成功した。これにより触媒部位がβ-バレルのC末端側に位置することがほぼ確実となった。2)マグネシウムイオンとの結合に関与する触媒部位の残基を推定した。3)トウモロコシのC4光合成に関与するPEPCの結晶解析に成功し、基本構造の大腸菌酵素との類似点と相違点を明らかにした。4)トウモロコシ酵素についてリン酸化部位に種々の変異を導入した。このリン酸化に関与するプロテインキナーゼによる認識機構の解析を進めつつある。5)PEPCは糖リン酸化合物による活性化を受けるが、これに関与する残基が推定されたので、これに変異を導入し、その性質を調べている。6)トウモロコシ酵素について触媒部位のループ構造に変異を導入した。大腸菌酵素の場合と同様に触媒機能の向上がみられるかどうかを検討している。

Research Products

• [Publications] Y.Kai: "Three-dimensional structure of phosphoenolpyruvate carboxylase"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96・3. 823-828 (1999)
• [Publications] H.Matsumura: "Plausible phosphoenolpyruvate binding site revealed by 2.6 A structure of Mn2+- bound phosphoenolpyruvate carboxylase from Escherichia coli"FEBS Lett.. 458・2. 93-96 (1999)
• [Publications] H.Matsumura: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of C4-form phosphoenolpyruvate carboxylase from maize"Acta Cryst.. D55・11. 1937-1938 (1999)
• [Publications] K.Tsumura: "Role of flexible loop in catalytic activity of phosphoenolpyruvate carboxylase"発売予定.