1998 Fiscal Year Annual Research Report
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10480181
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
後藤 祐児 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (40153770)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳田 敏雄 大阪大学, 医学部, 教授 (30089883)
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| Keywords | 一分子計測 / 蛍光顕微鏡 / 分子シャペロン / GroEL / βラクトグロブリン / 蛋白質 / フォールディング |
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| Research Abstract |
蛋白質の立体構造形成(フォールディング)反応は蛋白質の構造形成を担うだけでなく、病気など、生命機能と直結する重要な問題である。近年、蛋白質をはじめとする生体分子の構造や機能を、単一分子レベルでの操作や測定によって解析しようとする研究が始まっている。中でも全反射蛍光顕微鏡を用いた単一分子蛍光スペクトルの直視法は、フォールディング反応の解析に応用できると期待できる。本研究は、蛍光標識を導入した蛋白質のフォールディング反応を単一分子レベルで測定することを目的とする。今年度は、以下の成果を得た。
基質蛋白質と分子シャペロンGroELの相互作用を、蛍光顕微鏡を用いて、単一分子レベルで解析することを試みた。まず、蛍光色素cy5で修飾したβラクトグ口ブリンと、テトラメチルローダミンで修飾したGroELを調製した。これらを結合することをゲルろ過によって測定した。結合は、塩濃度に大きく依存して、低塩濃度の条件では相互作用は弱いのに対して、高塩濃度では強い結合が観測された。また、βラクトグロブリンのジスルフィド結合を切断すると、結合は強くなった。
次に、ゲルろ過カラムから溶出されたGroELとβラクトグ口ブリンの複合体の分画を蛍光顕微鏡によって観測した。テトラメチルローダミンの蛍光からGroELの存在する位置を特定し、cy5の蛍光からβラクトグロブリンの位置を特定した。これらのいくつかが一致することから、単一分子レベルで複合体を形成していることが確認された。
更に、cy5で修飾したローダナーゼを基質蛋白質として用いることにより、フォールディング反応の途中でGroELにトラップされたローダナーゼが、ATPを加えると解離することを、一分子観察した。
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[Publications] Hagihara,Y.: "Chain-like conformation of the heat-denatured ribonuclease A and cytochrome c as evidenced by X-ray solution scattering." Folding & Design. 3・3. 195-201 (1998)
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[Publications] Kuwata,K.: "α→β Transition of β-lactoglobulin as evidenced by heteronuclear NMR." J.Mol.Biol.283・4. 731-739 (1998)
