ナノ秒温度ジャンプを用いた蛋白質高次構造変化の時間分解振動分光学的研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10480187
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 北川 禎三 岡崎国立共同研究機構, 統合バイオサイエンスセンター, 教授 (40029955)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小倉 尚志 東京大学, 大学院・総合文化研究科, 助教授 (70183770) ; 水谷 泰久 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 助手 (60270469)
• Keywords: 温度ジャンプ / 時間分解ラマン / ナノ秒温度ジャンプ / リボヌクレアーゼ / 蛋白質熱変性 / 振動分光 / 蛋白質アンフォルディング

Research Abstract

ヒート光の波長の異なる温度ジャンプ装置を2種製作した。第1は1.89μmパルスをヒート光とし、第2は1.56μmパルスをヒート光とするもので、各々QスイッチNd:YAGレーザー励起のH_2或いはD_2ストークス誘導ラマン光として作り出した。これをMoO_4^<2->水溶液に照射し、そのΔt秒後のストークスラマンとアンチストークスラマンを別のNd:YAGレーザーによる532nmのパルス光で測定し、その相対強度から温度上昇値を得た。ヒート光をサンプルセルの表裏両側から照射する事により、セル内の温度分布の幅が狭くなるよう工夫した。1.56μmのパルス光では32℃、1.89μmのパルス光では9℃の温度ジャンプを達成する事に成功した。上昇した温度は3ミリ秒持続することが明らかになった。1.59μmの場合はセルの厚さが20μm以下にしないと温度分布が広くなりすぎるが、20μmの厚さでは蛋白質濃度を飽和溶液まで高くしてもラマン線は見えなかった。1.89μmの場合はセルの厚さを2mmまで厚くできた。ウシ膵臓のリボヌクレアーゼAの温度ジャンプを1.89μmのパルスで行い、その時間分解ラマンスペクトルを532nmの9nsパルスで測定した。62℃から71℃への温度ジャンプによるラマンスペクトルの変化量を、それぞれの温度の平衡状態にある場合のスペクトル変化量と比較した。メチオニンのC-S伸縮振動は200ナノ秒で平衡値の10%、5ミリ秒後でも20%であった。活性部位に結合している硫酸イオンの980cm^<-1>のバンドは100マイクロ秒後に強度増加を示した。しかしシステイン橋のS-S伸縮振動やチロシンダブレットは5ミリ秒後でもあまり変化しなかった。これにより、蛋白の熱アンフォルディングは協奏的には起らず、この時間スケールでは時間的にバラバラである事が明らかになた。この他にウマのチトクロムC酸化形の50→60℃への温度ジャンプ実験をして、ヘム鉄への配位変化は500マイク秒のあたりで起る事がわかった。

Research Products

• [Publications] K.Yamamoto et al.: "Nanosecond Temperature Jump and Time-resolved Raman Study of Thermal Unfolding of Ribonuclease A"Biophysical Journal. 79. 485-495 (2000)
• [Publications] K.Yamamoto et al.: "Construction of Novel Nanosecond Temperature Jump Apparatuses Applicable to Raman Mesurements and Direct Observation of Transient Temperature"Applied Spectroscopy. 54. 1591-1604 (2000)