1998 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子工学的手法を用いた低濃度水中病原微生物の検出手法の開発
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10555189
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
大垣 進一郎 東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (20005549)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片山 浩之 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (00302779)
大瀧 雅寛 東京大学, 大学院・工学系研究科, 講師 (70272367)
神子 直之 茨城大学, 工学部, 助教授 (70251345)
矢野 一好 東京都立衛生研究所, 環境保健部, 主任研究員
古米 弘明 東京大学, 大学院・工学系研究科, 教授 (40173546)
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| Keywords | PCR / ウイルス / 水中微生物 / 検出 / 濃縮 / ゲノム / 陰電荷膜 / 酸洗浄 |
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| Research Abstract |
1. はじめに
水の微生物学的安全性を確保するための重要課題として、水系感染性の腸管系ウイルスが挙げられる。ウイルスを検出する方法としてはPCR法が簡便性および検出感度に優れている。一方、既存のウイルス濃縮法は、PCR法による検出に適していない。ここでは、RT-PCR法による検出を前提としたウイルス濃縮法(陰電荷膜吸着・酸洗浄・アルカリ誘出法)の開発を試みた。
2. 実験方法
モデルウイルスとして、大腸菌RNAファージQβを用いた。QβのゲノムRNAは、TaqMan PCR法を用いて定量し、ウイルス濃縮法の回収率を算出した。濃度既知のQβ液の100^<0.5>倍希釈列を毎回作成し、TaqManPCRの蛍光強度とQβ濃度の対数に直線関係を検量線としてQβゲノムを定量した。
ウイルス濃縮の陰電荷膜として混合セルロース膜(口径47mm、公称孔径0.45μm)を滅菌して使用した。MgCl_250mMを加えたろ過原水を約100ml/minでろ過したのち、pH5程度の希硫酸溶液を洗浄液として膜にとおした。誘出工程では、pH12程度のNaOH溶液5mlを同じ膜でろ過し、ろ液を回収して中和した。
3. 実験結果および考察
ウイルス濃縮法開発の実験結果の例として、洗浄液量と回収率の関係を以下に記す。希硫酸による洗浄液量が500〜1000mlのときに、Qβゲノムの回収率が高かった。この範囲では、吸引ありの誘出工程の方が高い回収率(45%、標準偏差19%)を示した。また、洗浄掖量を2000mlに増やしても効果はなかった。ろ過原水1000mlを用いた場合、洗浄液量500mlでQβゲノムの回収率は19%であった。
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