1999 Fiscal Year Annual Research Report
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10555288
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| Research Institution | KYOTO INSTITUTE OF TECHNOLOGY |
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Principal Investigator |
功刀 滋 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (70111929)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
河合 昭治 テラメックス株式会社, 常務取締役(研究職)
平賀 和三 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 助手 (50252549)
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| Keywords | 耐性酵素 / 高圧力 / 高温 / 誘導 / 人工条件 / スクリーニング / 有機溶媒 |
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| Research Abstract |
耐圧性および耐溶剤性酵素を産出する菌種を得るために、耐熱性の評価に準じるほど簡便なScreening法を開発することを目指した。さらに、化学的修飾法により、通常酵素を人工条件耐性の酵素へ改変することもおこったが、これには、申請者らが開発してきた高圧力による可逆的変性を利用したタンパク質内部修飾法適用の可否を調べることにより行った。このようにして得られた人工条件耐性酵素の構造安定化の機構を調べ、さらに特異的機能の発現機構を知るべく、各種分光学的方法および構造学的方法により精査した。
1.耐性酵素の開発
微生物・細胞の高圧下での直接観察を、高圧顕微鏡ステージを使って実現するとともに、高圧プレスを利用した簡便なスクリーニング技法を考案した。
化学修飾法による耐性の付与により、通常酵素を耐性酵素に改変することをおこなうため、高圧力による可逆的変性を利用したタンパク質内部修飾法の適用の可能性を調べた。高圧変性下での修飾により、タンパク質内部に修飾基を導入できるので、疎水性相互作用部位や水素結合部位あるいは塩橋部位の内部への導入による、人口条件耐性の付与の可能性を探った。
2.耐性酵素による人工条件下での触媒反応の選択的特異化
上記によって獲得した耐性酵素が高圧下や溶剤中で示す特異的な反応性を調べ有用物質生産に可用なものを対象に、その特性解析を行った。
構造化学的解析方法としては、特に分光化学的方法を重用した。通常条件下(ex situ)でのNMR、CD測定の他、通常・人工両条件下(in situ)双方での、4次微分吸光、FTIR、蛍光(定常・過渡)スペクトル測定などを行った。さらに、高圧電気泳動法を用いた。
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[Publications] H.Ikeuchi 他: "Activity and stability of a neutral protease from Vibrio Sp.(vimelysin) in a pressure-temperature gradient"European Journal of Biochemistry. (in press). (2000)
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[Publications] S.Kunugi 他: "Pressure-assisted cold-denaturation of carboxypeptidase Y"Bulletin of the Chemical Society Japan. 72(12). 2803-2806 (1999)
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[Publications] S.Kunugi 他: "Single-point amino acid substitutions at the 119th residue of thermolysin and their pressure-induced activation"FEBS Letters. 462(3). 231-235 (1999)
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[Publications] S.Kunugi 他: "Studies on the formation and stability of a complex between Streptomyces proteinaceous metalloprotease inhibitor and thermolysin"European Journal of Biochemistry. 259. 815-820 (1999)
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[Publications] G.-Q.Tang 他: "Salt Effects on Fluorescence spectral Shifts of DNA-bound Hoechst 33258 and Reaction Volumes of the Minor Groove Binding"Bulletin of the Chemical Society Japan. 72(5). 1129-1137 (1999)
