1999 Fiscal Year Annual Research Report
組織特異的転写プロモーターの家畜遺伝子治療への応用-牛バンド3欠損症をモデルとした赤血球特異的GATA-1プロモーター応用の試み-
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10556071
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
稲葉 睦 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (00183179)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 迪雄 株式会社 味の素, 理事 (30011943)
山本 雅之 筑波大学, 基礎医学系最先端学際領域研究センタ, 教授 (50166823)
小野 憲一郎 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (50111480)
松木 直章 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助手 (40251417)
高桑 雄一 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (40113740)
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| Keywords | 赤血球 / 転写因子 / プロモーター / GATA-1 / バンド3 / 遺伝性疾患 / 遺伝子治療 / 家畜 |
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| Research Abstract |
本研究では、牛のGATA-1遺伝子領域を単離し、マウスで得られた結果をもとに、プロモーター領域の構造を特定する。次いで、それが実際に赤血球系細胞で選択的に遺伝子発現を増強することを、まずレポーター遺伝子としてのLacZ(β-galactosidase)、あるいはLuc(Luciferase)の発現で、次いで実際にバンド3遺伝子の発現で実証する。
1.牛赤血球系細胞特異的GATA-1プロモーター領域の同定
(1)牛GATA-1遺伝子の単離:牛ゲノムDNAライブラリーを作製、5'上流領域を含む牛GATA-1遺伝子領域を単離して塩基配列を解析した。
(2)プラスミドの構築と発現検索:細胞での一過性発現のために、pSv-βベクター(LacZ)のレポーター遺伝子上流に牛GATA-1のプロモーター領域と推定される配列を組み込んだプラスミドベクターを構築した。これをCOS-7、HEK、K562の各培養細胞に導入し、レポーターの特異的発現を検討したところ、K562で有意な発現が観察された。
2.バンド3導入プラスミドの構築と細胞における発現
(1)上記プラスミドのレポーター遺伝子を牛バンド3cDNAに置換したバンド3遺伝子導入プラスミドpPGATAB3を構築した。これを牛骨髄細胞に導入して赤血球系細胞におけるバンド3の発現を既存の抗牛バンド3抗体を用いて検討している。
3.体細胞クローン作出への準備
(1)バンド3欠損症補も接合型個体で皮膚のバイオプシーを行い、線維芽細胞を培養、ゲノムでの遺伝子異常を確認した。今後、上記プラスミドからプロモーター領域を含む、あるいは含まれないDNAを調製、導入して発現効率を検討する予定である。
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[Publications] Matsumoto,M、他2名: "Molecular basis of bovine red cell protein 4.2 polymorphism in Japanese black cattle"Biochem.J.. 332. 183-187 (1998)
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[Publications] Uchide,T、他6名: "Utilization of intestinal triglyceride-rich lipoproteins in mammary gland of cows"J.Vet.Med.Sci.. 61. 1143-1146 (1999)
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[Publications] Sato,K、他6名: "Inherited defects of sodium-dependent glutamate transport mediated by glutamate/aspartate transporter in canine red cells due to a decreased level of transporter protein expression"J.Biol.Chem.. 275. 6620-6627 (2000)
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[Publications] Inada,M.: "Red blood cell membrane defects(Chapter 156)In Schalm's Veterinary Hematology,5th ed.(Feldman,R.F,Zinkl,J.G,and Jain,N.C.eds)"Lippincott Williams and Wilkins,New York (in press). 約1,000 (2000)
