肝ガンに特異的な変異糖鎖に対する単クローン抗体の作製とその診断学的評価

1999 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10556079
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 熊谷 英彦 京都大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (70027192)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福味 廣員 福井工業大学, 工学部, 教授 (90288340) ; 石原 秀晴 岐阜大学, 工学部, 教授 (60021599) ; 山本 憲二 京都大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (70109049) ; 澤武 紀雄 金沢大学, がん研究所, 教授 (90019969)
• Keywords: 肝ガン / 単クローン抗体 / 変異糖鎖 / α-フェトプロテイン / トランスフェリン / エンドグリコシダーゼ / 糖転移活性

Research Abstract

本研究は、肝ガン患者の血清中に特異的に出現すると考えられている糖タンパク質のα-フェトプロテインよりもより特異的にガン性変異を反映するその糖鎖に注目し、この変異糖鎖に特異的な単クローン抗体を作製して、肝ガンの検査試薬を開発することを目的としている。鶏卵卵黄に存在する糖ペプチドに結合する複合型二本鎖糖鎖はα-フェトプロテインの変異糖鎖に構造が類似しているので、本糖ペプチドを微生物のエンドグリコシダーゼを用いて免疫賦活物資に転移させた後、これを抗原として単クローン抗体の作製を試みた。
1.鶏卵の卵黄よりフェノール抽出、イオン交換およびゲル濾過カラムクロマトグラフィーによってN-結合型糖鎖(複合型二本鎖糖鎖)を有する糖ペプチドを大量調製した。
2.調製した糖ペプチドを糖鎖供与体として、糸状菌のエンドグリコシダーゼの特異的な糖鎖転移活性を利用して、免疫賦活作用を持ちかつ抗原性に乏しい糖アルキル(オクチルグルコシド)に糖鎖を転移付加し、生成物であるアルキルグリコシド(アルキル糖鎖)を多量に得た。
3.得られたアルキル糖鎖に対する単クローン抗体の作製を試みた。即ち、アルキル糖鎖を抗原としてマウスの腹腔内に注射し免疫した。脾臓細胞をマウスより摘出してミエローマと細胞融合し、抗体を産生するハイブリドーマを複合型二本鎖糖鎖を含むヒト血清トランスフェリン糖ペプチドと糖鎖をグリコペプチダーゼ処理によって除いたトランスフェリンペプチドとの反応性を調べて検索した。その結果、いくつかの抗体産生株を得て、抗体のクラスがIgMである可能性が示唆されたハイブリドーマを高産生株として選んだ。
4.ハイブリドーマをマウスの腹腔内に注射して腹水を採取した。腹水中にトランスフェリン糖ペプチドの複合型二本鎖糖鎖と反応する単クローン抗体が存在することを確認した。

Research Products

• [Publications] S.Akiba et al.: "Transglycosylation Activity of the Endo-β-1,4-Glucanase from Aspergillus niger IFO31125 and Its Application"J.Biosci.Bioeng.. 87・5. 576-580 (1999)
• [Publications] H.Ashida et al.: "Characterization of Endo-α-N-acetylgalactosaminidase from Bacillus sp.And Syntheses.of Neo-oligosaccharides Using Its Trans-glycosylation Activity"Arch.Biochem.Biophys.. 373・2. 394-400 (2000)