温度感受性SV40T抗原遺伝子導入動物を用いた血液脳関門培養細胞実験系の開発

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10557227
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 寺崎 哲也 東北大学, 薬学部, 教授 (60155463)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福島 清実 大正製薬, 開発研究所・薬物動態研究室, 室長 ; 菊池 明彦 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (40266820) ; 帯刀 益夫 東北大学, 加齢医学研究所, 教授 (10099971) ; 細谷 健一 東北大学, 教務職員 (70301033)
• Keywords: 血液脳関門 / 脳毛細血管内皮細胞 / 温度感受性SV40T抗原遺伝子導入トランスジェニック動物 / 脳 / 不死化細胞クローン / P-糖蛋白 / GLUT-1 / グルコース輸送

Research Abstract

温度感受性SV40T抗原遺伝子導入トランスジェニックマウスの大脳より脳毛細血管内皮細胞をcollagenase/dispase処理及び密度勾配法により採取し、10%FBS含有DMEM培地にて5%CO_2雰囲気下33度で培養した。増殖の速い細胞株について2回コロニー形成を行い、ペニシリンカップを用いて単一細胞由来の細胞株(TM-BBB)5株を単離した。これらTM-BBBは内皮細胞特有のspindle-fiber状の形状を示し、Western blot法によりSV40T抗原の発現が明らかとなった。TM-BBBは20から25時間のdoubling timeで増殖し、100代の継代においても細胞の形状に大きな変化はなかった。脳毛細血管内皮細胞での存在が報告されているGLUT-1及びP-糖蛋白が発現していることがWestem blot法により明らかとなった。さらに、Northern blot法によりin vivoに発現しているP-糖蛋白のmRNA、mdr 1aの発現が明らかとなり、単離した細胞株は脳毛細血管内皮細胞であることが示された。さらにGLUT-1の基質である[^3H]-3-O-methyl-D-glucose([^3H]-3-OMG)の細胞内取り込み量は少なくとも30秒は直線を示し、その初期取り込み速度は2.6から5.3 μl/(min・mg protein)であった。[^3H]-3-OMGのTM-BBBの取り込みは濃度依存性を示した。Michael is定数は6.6mM、最大取り込み速度は44nmol(min・mg protein)であった。従って、本法によって増殖可能で3-OMG(D-glucose)の輸送機能を有した脳毛細血管内皮細胞株が樹立できた。

Research Products

• [Publications] T.Kitazawa: "Efflux of taurocholic acid across the blood-brain barrier:Interaction with cyclic peptides." J.Pharmacol.Exp.Ther.286. 890-895 (1998)
• [Publications] T.Terasaki: "The blood-brain barrier efflux transporters as a detoxifying system for the brain." Adv.Drug Deliv.Rev.(in press). (1998)
• [Publications] S.Song: "Modulation of the tumor disposition of vinca alkaloids by PSC833 in vitro and in vivo." J.Pharmacol.Exp.Ther.287. 963-968 (1998)
• [Publications] T.Terasaki: "Development of Brain Efflux Index(BEI)Method and Its Application to the Blood-Brain Barrier Efflux Transport Study:in“An Introduction to the Blood-Brain Barrier:Methodology and Biology"." W.M.Pardridge,Cambridge Univ.Press., 8 (1998)