遺伝子組換え技術を用いたヒト型蛋白質の細胞内挙動制御による治療効果の改善

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10557230
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 杉山 雄一 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (80090471)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 基浩 中外製薬(株), 薬物動態研究所, 研究主査 ; 中村 敏一 大阪大学, 医学部, 教授 (00049397) ; 滝川 一 帝京大学, 医学部, 教授 (70197226) ; 加藤 将夫 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (30251440) ; 鈴木 洋史 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教授 (80206523)
• Keywords: 細胞内挙動 / ドラッグデリバリーシステム / 生理活性蛋白質 / レセプター / エンドサイトーシス

Research Abstract

本年度は肝細胞増殖因子(HGF)を中心に、治療効果の改善を目的とした遺伝子組換え技術による細胞内挙動制御を試みた。HGFはヘテロな2本鎖からなる蛋白質であるがそれらが相補的に働くことによってレセプターを介したシグナル伝達の起こることが明かとなった。しかしレセプター結合部位自身はN末端に近い部分に存在することからC末端側に小胞体ならびに核移行シグナルを導入しCOS-7細胞にて発現させ組換え蛋白質を回収した。蛋白質の発現量が期待したほどではなかった点を除くと活性(ラット初代培養肝細胞に対する増殖促進効果)を保持した形での回収に成功し、得られたリガンドを^<125>I標識した。HGFレセプターを発現した細胞株(KB細胞)に添加し細胞内挙動を検討したところ、レセプターへの結合、内在化に関してはwild-typeHGFとほとんど同じである一方、lysosomal degradationは組換え体で大きく低下し、本手法によって細胞内挙動を制御することが可能であることが明かとなった。より詳細な解析を行うため大量合成を目的として現在バキュロウィルスによる組換え体の合成を行っている。同様な手法の一般的な応用性を明かにする目的でエリスロポエチン(EPO)についても検討を開始した。EPOについては未だ体内動態に関する検討が不十分であるため、レセプター介在性エンドサイトーシスの関与、特にレセプターのup/down-regulationについて検討を行ったところ、EPOによる脾臓レセプターup-regulationのメカニズムの解明に成功し、体内動態評価系の確立が終了した。来年度はさらに本遺伝子組換え手法を応用し、in vivo体内動態ならびに薬効の評価につなげたいと考えている。

Research Products

• [Publications] Ke-Xin Liu: "Ligand-induced downregulation of receptor-mediated clearance of hepatocyte growth factor in rats" Am.J.Physiol.275. E835-E842 (1998)
• [Publications] Motohiro Kato: "The mechanism of erythropoietin induced up-regulation of its uptake clearance by spleen" Am.J.Physiol.(in press).
• [Publications] 加藤将夫: "シグナル配列を持った肝細胞増殖因子のレセプター介在性エンドサイトーシスと細胞内動態の解析" DDS研究の進歩. 7. 71-79 (1998)
• [Publications] Kunio Matsumoto: "Cooperative interaction between alpha- and beta-chains of hepatocyte growth factor on c-Met receptor confers ligand-induced receptor tytosine phosphorylation and multiple biological responses" Journal of Biological Chemistry. 273. 22913-22920 (1998)
• [Publications] S.Mizuno: "Hepatocyte growth factor prevents renal fibrosis and dysfunction in a mouse model of chronic renal disease" Journal of Clinical Investigation. 101. 1827-1834 (1998)
• [Publications] A.Bosch: "Effects of keratinocyte and hepatocyte growth factor in vivo: implications for retrovirus-mediated gene transfer to liver" Human Gene Therapy. 9. 1747-1754 (1998)