相同組換えを応用したin vivoでの転写活性測定法の開発

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10557240
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 井ノ上 逸朗 群馬大学, 生体調節研究所, 助教授 (00192500)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 持田 弘 (有)蛋白精製工業, 取締役 ; 武田 純 群馬大学, 生体調節研究所, 教授 (40270855)
• Keywords: 相同組換え / 転写活性 / common disease

Research Abstract

最近、ヒトのcommon disease において、発症原因としてのプロモーター領域の遺伝子変異が数多く報告されている。例えば、血圧調節において重要なアンギオテンシノーゲン遺伝子においてTATA boxと転写開始点との間に生じた塩基置換が転写活性に影響を及ぼし、本態性高血圧症の原因となることを我々は明らかにした。現在、培養細胞とプラスミドを用いたレポーター転写実験法で転写活性が測定されているが、これらの成績は生体の生理条件を反映しているとは、言い難い。特に慢性疾患に関連する僅かな転写活性の差を検出するのは不可能で、新たな転写活性測定法が必要と考えられた。
ES細胞を用いた相同組換え法は、近年マウス発生工学手法として頻繁におこなわれている実験手法であり、体細胞でも可能となっている。本研究ではプロモーター変異を目的細胞に相同組換えで導入することにより、ヌクレオゾームを含むin vivoでの転写への影響を調べる。この1年は目的を遂行するため、プラスミド構築をおこなった。マウスアンギオテンシノーゲン(agt)遺伝子を129系のマウス遺伝子ライブラリーより分離した。そしてプロモーター領域とエクソン1そしてイントロン1の一部を含む長さ13kbのクローンを pBluescriptに組み込んだ。そしてこのインサートをターゲティング用ベクター(TT222).ユタ大カペッキー教授から供与、に導入することができた。今後、目的とするTATA boxと転写開始点の遺伝子点変異(G-6A)をPCR mutagenesisにより作成し、ターゲットベクターに導入する。また一方で、アレルの片方を破壊すると、変異の転写活性への影響を測定しやすいので、エクソン1にneo遺伝子を組み込んだベクターも作成中である。