医学的有効性の向上を目的とした組換え型アルブミン製剤の設計と機能性評価

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10557245
• Research Institution: KUMAMOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 小田切 優樹 熊本大学, 薬学部, 教授 (80120145)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 桑田 茂喜 化学及血清療法研究所, 主任研究員 ; 今井 輝子 熊本大学, 薬学部, 客員教授 (70176478) ; 棚瀬 純男 熊本大学, 医学部, 助教授 (20112401)
• Keywords: アルブミン製剤 / 遺伝子組換え技術 / 分子設計 / 血液製剤 / 人工血液 / 機能性評価

Research Abstract

本研究は、当研究室において構築された遺伝子組換え技術を基に、安全性ならびに有効性に優れたアルブミン製剤を開発することを目的として実施され、以下の知見が得られた。
1)発現ベクターpHIL-D2にL10(シグナル配列)及びポリA配列を含む変異を施したHSAcDNA(K199A,K525A)を挿入した。この発現ベクターでP.Pastoris(GS115株)を形質転換し、BMMY培地で4日間培養後、培地上清より硫安分画(60%,pH4.4)で濃縮、粗精製を行い、ブルーセファロースCL-6Bに付し、変異HSA(K199A,K525A)の精製を行った。
2)精製した変異HSA(K199A、K439A、K525A及びK199A/K439A/K525A)の構造特性について、遠紫外及び近紫外領域CDスペクトル、抗HSAポリクローナル抗体を用いて検討した。その結果、二次構造、三次構造及び抗体の認識性に血漿由来HSAと有意な差は観察されなかった。
3)変異HSAは化学的安定性、熱安定性、薬物輸送性及びエステラーゼ様活性において血漿由来HSAと有意な差は観察されなかった。
4)^<125>Iでラベル化した変異体の静注後の血漿中濃度推移は2相性を示し、消失相(β相)から算出した半減期は、いずれの場合も血漿由来HSA(約30時間)より短かった。
以上のように、アルブミン変異体の分子設計が可能となったが、本研究の所期の目的である医学的有効性に優れた変異体の設計に至らず、今後の大きな課題として残すことになった。

Research Products

• [Publications] K.Yamasaki et al: "Interactive binding to the two principal ligand binding sites of HSA : effect of the N-B transition"Biochimca et Biophysica Acta. 1432. 313-323 (1999)
• [Publications] V.T.G.Chung et al: "Helix of subdomain IIIA of HSA is the region primarily photolabeled by ketoprofen"Biochimica et Biophysica Acta. 1434. 18-30 (1999)
• [Publications] Y.Tsutsumi: "Decreased bilirubin binding capacity in uremic serum caused by an accumulation of furan dicarboxylic acid"Nephron. 85(1). 60-64 (2000)
• [Publications] H.Watanabe et al: "Role of Arg-410 and Tyr-411 in human serum albumin for ligand binding and esterase-like activity"Biochemical Journal. 349. 813-819 (2000)
• [Publications] T.Sakai et al: "Interaction Between indoxyl sulfate, a typical uremic toxin bound to site II, and ligands bound to site I of HSA"Pharmaceutical Research. 18(4)(in press). (2001)
• [Publications] H.Watanabe et al: "Conformational stability and warfarin binding properties of human serum albumin studied by recombinant mutants"Biochemical Journal. (in press). (2001)
• [Publications] 丸山徹,小田切優樹(分担)沢田康文 他(編集): "医薬品の適正使用のための臨床薬物動態"じほう. 834 (2000)
• [Publications] 小田切優樹,今井輝子(分担)永井恒司(監修): "新・ドラッグデリバリーシステム"シーエムシー. 227 (2000)