ゲノムDNA情報が不要となる血液中の微量mRNAを用いた迅速遺伝子解析法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10557250
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 巽 圭太 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (00222109)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小松原 秀介 東洋紡, 郭賀バイオ研究所, 研究員
• Keywords: 遺伝子解析法 / RT-PCR / mRNA / cDNA

Research Abstract

昨年度はヨード輸送蛋白(NIS)mRNAの発現を、発現組織である甲状腺の他、末梢血でも一回のPCRで増幅して確認出来たが、口腔粘膜は利用困難であることを明らかにした。また、一塩基置換でもRT-PCRの効率に影響することも示唆された。
本年度は、V59E一塩基置換によるRT-PCRの効率に対する影響がPCRによるものであることを明らかにした。
ヨード輸送蛋白(NIS)では正常のアミノ酸は59Vと354Tであるが、対立遺伝子の一方にV59E、他方にT354Pと、二つの一塩基置換を複合ヘテロ接合体として持つ症例で、ゲノムを増幅したときは両者各々がほぼ同等に増幅された。それに対し、甲状腺や抹消リンパ球からRNA抽出、逆転写後、各々のアリルを別々にPCR-制限酵素切断で量比を見ると、一方(V59E)の部位では正常(wt)が変異のアリルに対し有意の多く認められ、一塩基置換がPCRの効率に影響したと考えられました。プラスミドを用いて検討した結果も同様の結果が得られ、現在使っている酵素では特定の条件下にある一塩基置換がPCR増幅に影響を起こすことを明らかにした。
本研究より、微量のmRNAよりcDNAを合成し、PCR増幅する時にartifactが生じる危険性が明らかにされた。

Research Products

• [Publications] Fujiwara H., et al.: "A novel V59E missense mutation in the Na+ /I- symporter gene in a family with iodide transport defect."Thyroid. 10. 471-474 (2000)
• [Publications] Matsuo T, et al.: "A novel mutation of the KAL 1 gene in monogygotic twins with Kallmann syndrome."Eur J Endocr. 143. 783-787 (2000)
• [Publications] Kimura M, et al.: "Enzyme immunoassay for autoantibodies to human liver-type arginase and its clinical application"Clin Chem. 46. 112-117 (2000)
• [Publications] Watanabe K, et al.: "Characteristics of experimental autoimmune hypophysitis in rats : Major antigens are growth hormone, thyrotropin, and luteinizing hormone in this model."Autoimmun. (in press).
• [Publications] Izumi Y, et al: "Analysis of the KAL1 Gene in 19 Japanese patients with Kallmann syndrome"Endocr J. (in press).