X線結晶解析を指向したタンパク質結晶化の実用的支援法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10558098
• Research Institution: RIKEN
• Principal Investigator: 加藤 博章 理化学研究所, 速度論的結晶学研究チーム, チームリーダー(研究職) (90204487)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山野 昭人 理学電機(株), X線研究所, 研究員 ; 平竹 潤 京都大学, 化学研究所, 助教授 (80199075) ; 前田 雄一郎 理化学研究所, 構造生物化学研究室, 主任研究員 (10321811)
• Keywords: タンパク質の結晶化 / X線結晶構造解析 / 動的光散乱 / 結晶化能 / 遷移状態アナログ / タンパク質化学 / γグルタミルシステイン合成酵素 / アスパラギン合成酵素

Research Abstract

本申請課題の目的は、動的光散乱法を用いて結晶化能の定量を行うことを中心として、結晶化の可能性が低いと判定されたものを改質(良)するための対処法を体系化することにある。本年度得られた結果は以下の通りである。
(1)動的光散乱法による結晶化の判定基準について検討した結果、新たに開発されたDYNALSプログラムを用いて散乱強度の分子サイズに対する分布をグラフ化することにより、判定基準を明確にすることができた。トロピノン還元酵素IIについては、生成物との複合体の結晶を調整し、X線結晶解析することができた。特に、微量セル装置の導入で極微量での判定が可能になった。また、新型顕微鏡の導入で詳細な画像の解析が可能になった。
(2)いまだ結晶化することができていないγグルタミルシステイン合成酵素を結晶化するために、酵素と結合することで酵素の立体構造を均一化させることに寄与すると思われる遷移状態アナログを合成した。その化合物は6種類のジアステレオマー混合物であったため、さらに光学活性な化合物を作り分けた。
(3)ルシフェラーゼの結晶化条件の改良を検討したところ、硫酸リチウムの代わりに塩化リチウムを用いることにより界面活性剤の添加なしに良質の結晶を作ることができた。その結晶についてX線回折像を撮影したところ、空間群P2_12_12_1で、a=57.8,b=181.9,c=53.6Åであることが判明した。現在、分子置換法によるX線結晶解析を進めている。
(4)X線結晶構造解析結果をもとにアスパラギン合成酵素の結晶化能の向上の理由の解明を行った。その結果、分子間相互作用、特に結晶格子中への分子の組み込まれ方と、変異導入部位との関係を解析して、結晶化能が向上した理由を考察した。その結果、Cys315は、二量体を形成する際に互いのサブユニットが接する付近にあることから、そのアラニンへの変更はサブユニット間相互作用に影響を与えたものと考えられた。また、アスパラギン合成酵素の遷移状態アナログの合成にも成功した。