解糖系酵素の遺伝子発現調節機構を利用した有用蛋白質生産のための動物細胞工学

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10559014
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 佐々木 隆造 京都大学, 農学研究科, 教授 (60077378)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白井 義人 九州工業大学, 情報工学部, 助教授 (50175395)
• Keywords: 解糖系 / 低酵素 / エリスロポエチン / 転写調節 / 細胞工学

Research Abstract

低酸素応咎性領域を含む乳酸脱水素酵素A(LDHA)のプロモーターの下流にエリスロポエチン遺伝子を接続した発現ベクターを構築した。また、コントロールとして低酸素応答性領域に変異を導入し、低酸素応答性がない発現ベクターを構築した。これらの発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣(CHO)胞に導入して、安定形質導入細胞株を得た。期待通り、野生型の低酸素応答性領域を持つ発現ベクターが導入された細胞では、明らかな低酸素誘導性(約10倍以上)のエリスロポエチン産生が見られ、一方変異型の低酸素応答性領域を持つ発現ベクターが導入された株では低酸素誘導性のエリスロポエチン発見は見られなかった。同様に、コバルトによる発現誘導も野生型の低酸素応答性領域を持つ株でのみ輯察された。エリスロポエチンは糖蛋白質で、その糖鎖はin vitroの活性には必要ではないが、in vivoの活性には必須である。低酸素条件下で細胞を培養して生産したエリスロポエチンが通常酸素圧下で培養した場合と同じ活性を持つか、つまり低酸素条件下でも同様な糖鎖の付加が見られるかについて検討した。その結果、SDS-PAGEでどちらの培養条件下でも同じ分子サイズのエリスロポエチンが産生されており、実際エリスロポエチン依存的に生育する細胞株を用いたin vitro活性測定法においても、飢餓ラットを用いたin vivo活性測定法においそも低酸素条件下で培養しても、通常酸素条件下で培養した場合と同程度の比活性を有するエリスロポエチンが産生されていることが確認された。また、今回用いたLDHAプロモーターは通常酸素条件下でも強力なプロモーターであり、さらに低酸素で誘導がかかることから、動物培養細胞による物質生産に有用であることが示唆された。

Research Products

• [Publications] Sakanaka, M.: "In vivo evidence that erthyropoietin protects neurous from ischemic damage" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 95・8. 4635-4640 (1998)
• [Publications] Sadamoto, Y.: "Erythropoietin prevents place navigation disability and cortical infarction permanent occlusion of the middle cerebral artery." Biochem.Biophys.Res.Commun.253・1. 26-32 (1998)
• [Publications] Yasuda, Y.: "Estrogen-dependent production of erythropoietin in uterus and its implication in uterine angiogenesis" J.Biol.Chem.273・39. 25381-25387 (1998)
• [Publications] 佐々木隆造: "赤血球造血因子(エリスロポエチン)の新しい生理機能の発見と生合成の調節機構に関する研究" 日本農芸化学会誌. 72・12. 1427-1437 (1998)
• [Publications] 増田 誠司: "エリスロポエチン遺伝子の発現制御-酸素による制御を中心にして-" BIO Clinica. 13・13. 1169-1173 (1998)
• [Publications] 増田 誠司: "赤血球造血因子(エリスロポエチン)-酸素による生合成の制御とその生理作用-" 栄養と健康のライフサイエンス. 4・1. 17-22 (1998)