2000 Fiscal Year Annual Research Report
解糖系酵素の遺伝子発現調節機構を利用した有用蛋白質生産のための動物細胞工学
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10559014
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| Research Institution | KYOTO UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
佐々木 隆造 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (60077378)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
白井 義人 九州大学, 情報工学部, 助教授 (50175395)
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| Keywords | 組換型蛋白質生産 / 動物細胞 / 酸素 / プロモーター / エリスロポエチン / 乳酸脱水酵素 / 糖鎖 |
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| Research Abstract |
動物細胞による蛋白質生産系の大きな問題点の一つは酸素供給である。他の栄養素は一時に過剰に添加することが出来るが、酸素は溶解度が低いため連続的に供給する必要がある。この研究は、これらの問題点を解決するために、低酸素により発現が誘導される遺伝子の特徴を利用したものである。
低酸素に応答して発現が誘導される遺伝子は多数発見されており、解糖系の酵素乳酸脱水素酵素A(LDHA)もその一例である。この遺伝子のプロモーターの特徴は、通常の酸素圧下でも強い転写活性を持ち、なお且つその活性が低酸素で誘導されることである。LDHAのプロモーターの下流にEPO遺伝子を接続したプラスミドを作製し、これをチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)細胞に導入し、多数の細胞株を取得した。この細胞株の中には、常酸素圧でもEPOを大量に生産し、しかも低酸素圧では更に生産が強く誘導される細胞株を発見した。なお、プロモーターの低酸素応答部位に変異を導入した場合には、EPOの生産が低酸素で誘導される株は得られず、酸素に応答する遺伝子の特徴が利用されていることを証明することが出来た。さらに、種々の酸素濃度で培養した培養上清よりEPOを単離し、in vtro及びin vivo活性を測定し、糖鎖を解析し、どの酸素条件で培養した場合でも一定の品質を持つEPOが生産せれていることをを示し、本研究で開発した方法が実用的に適していることを証明した。
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[Publications] 佐々木隆造 ら: "赤血球造血因子(エリスロポエチン)-酸素による生合成の制御とその生理作用"栄養と健康のライフサイエンス. 4. 17-22 (1999)
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[Publications] R.Sasaki ら: "Erythropoietic, neurotrophic and angiogonic functions of erythropoietin, and regulation of its production"Int.J.Hematol.. 70. 1-6 (1999)
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[Publications] R.Sasaki ら: "Erythropoietin"Encyclopedia of Bioprocess Technology. 1113-1122 (1999)
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[Publications] 佐々木隆造 ら: "エリスロポエチンと神経細胞"血液フロンティア. 9. 64-67 (1999)
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[Publications] R.Sasaki ら: "In vitro action of recombinant rat erythropoietin produced by astrocyte cell lines and comparative studies with erythropoietin produced by CHO cells"Cytotechnol.. 31. 177-182 (1999)
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[Publications] R.Sasaki ら: "HGF activates signal transduction from Epo-receptor on human cord blood CD34^+/CD45^+ cells"Stem Cells. 17. 82-91 (1999)
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[Publications] R.Sasaki ら: "A new biological strategy for higa productivity of recombinant proteins in animal cells by the use of hypoxia-response enhances"Biotech.Bioeng.. 67. 157-164 (2000)
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[Publications] R.Sasaki ら: "Restoration of low casein feed-induced decrease in serum EPO by fortifying diet with Met and Thr in normal and nephritic rats"Nut.Res.. 20. 685-693 (2000)
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[Publications] R.Sasaki ら: "Oviduct produces erythropoietin in an estroger-and oxygen-dependent manner"Am.J.Physiol.. 278. E1038-E1044 (2000)
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[Publications] R.Sasaki ら: "Tissue-specific regulation of erythropoietin production in mouse kidney, brain and uterus"Am.J.Physiol.. 279. E1242-E1248 (2000)
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[Publications] R.Sasaki ら: "RA stimulates EPO gene transcription in EC cells through the direct repeat of a steroid/thyroid hormone receptor response element half-site"Blood. 96. 3265-3271 (2000)
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[Publications] R.Sasaki ら: "Erythropoietin : Multiple physiological functions and regulation of biosynthesis"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64. 1775-1793 (2000)
