1999 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
10640673
|
|---|
| Research Institution | Okazaki National Research Institutes |
|---|
Principal Investigator |
小川 和男 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助教授 (30132731)
|
|---|
| Keywords | モーターたん白質 / ダイニン / P-ループ / モーター領域 / バキュロウィルス / ATPアーゼ活性 |
|---|
| Research Abstract |
はじめに: ダイニン重鎖は分子中に4つのATP結合配列を持ち、この点で、1つのATP結合配列しか持たない他の分子モーターであるキネシンやミオシンと区別される。本研究ではウニ精子外腕ダイニン重鎖のcDNAをバキュロウイルス発現系に組み込み、発現タンパク質のATPase活性を測定することで、重鎖のATPase活性部位を同定することを目的にした。
1.バキュロウイルス発現系ではダイニン重鎖(〜500kDa)の全長を発現させることはできたが、発現量は少なかった。中間鎖1と一緒に発現させることでその一部が可溶化されたが、ATPase活性は検出されなかった.想定される重鎖のモーター領域(〜400kDa)は分子のC末端側2/3に相当し、dual expressionでその一部が可溶化されたが、ATPase活性は検出できなかった。発現量は依然として僅かであった。
2.4つのP-looPをカバーするM領域(〜200kDa)では発現量は顕著であったが可溶化されたのは依然として一部であった。ATPase活性は極僅かではあったが検出された。
3.4つのP-looPをN末端側からP1、P2、P3、P4と呼ぶことにする。各発現断片に一つだけP-loopを含ませるようにさせる。いずれも発現タンパク質の一部のみが可溶化されるだけであったが、ATPase活性はわずかながらP1部位を含む断片のみにあった他のP-1oop配列を含む断片では検出されなかった。
考察:軸糸ダイニンおよびその断片は単独の発現では可溶化されなかったが、thioredoxin様活性をもつ中間鎖1とのdual expressionによってその一部が可溶化できるようになった。ATPase活性は発現タンパク質が大きいと検出されなかったが200kDa以下になると検出されるようになった。このことは分子が大きいとタンパク質のfoldlngが正しく行われない可能性があることを示唆している。
ATPase活性に関与するのは4つのうち最初の配列だけとの結論が出された。
Dual expressionによって発現タンパク質の可溶化の度合いはある程度改善されたが、それでも極僅かであった。タンパク質濃度に比べて低いATPase活性は、タンパク質のfoldingが完全にはうまくいっていない可能性があり、今後の検討課題である。
|
-
[Publications] K. Inaba, O. Kagami, K. Ogawa: "Tctex 2-related outer arm dynein light chain is phosphorylated at activation of sperm motility"Biochem, Biophys, Res. Commun.. 256. 177-183 (1999)
-
[Publications] S. Watabe et al.: "Mitochondrial this redoxin reductase in borine adrenal cortex : its purification, properties ・・・"Eor. J. Biochem.. 204. 74-84 (1999)
