放線菌細胞内外に生産される多機能ホスホリパーゼDに関する機能解析と効率的生産

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10650786
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 福田 秀樹 神戸大学, 自然科学研究科, 教授 (30263396)
• Keywords: ホスホリパーゼD / 放線菌 / 膜内ホスホリパーゼD / バイオ生産物の精製 / 組換え微生物 / 遺伝子のクローニング / 酵素反応

Research Abstract

本研究では、多彩な機能有する放線菌由来(Streptoverticillium cinnnamoneum)が産生する膜内在型および分泌型ホスホリパーゼD(PLD)の機能解析および組換え微生物による高発現の検討を試みた。
(1) 膜内在型PLD
膜内在型PLDの遺伝子解析を行うために、まず、大量精製法の技術確立を行った。すなわち、数段のステップによるクロマトグラフィーにより収量を大幅に増加させた。次に、膜内PLDの遺伝子クローニングにおいては、分泌型PLDをプローブとして膜内PLDのスクリーニングを行い、複数のクローンを得た。遺伝子配列の解析結果より、膜内在型PLDは従来報告されているPLDとは異なり、新規なPLDであることを示した。
(2) 分泌型PLD
分泌型PLDの大量生産法の検討においては、Stv. cinnnamoneum染色体遺伝子を大腸菌に導入し、高発現の検討を行った。発現用プラスミドには融合遺伝子を構築し、効率的な分離精製技術を確立した。培養においては、グルコース濃度と誘導の発現時期が大きく影響することを明らかにした。具体的には、グルコース濃度は培地中に低濃度に維持することおよび発現開始時間は培養開始後2時間後が良いことがわかった。

Research Products

• [Publications] Ogino,T.et al.: "Purification,Characterization,and Sequence Determination of Phospholipase D Secreted by Streptoverticillium cinnamoneum" Journal of Biochemistry. 125(2). 263-269 (1999)