2000 Fiscal Year Annual Research Report
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10660083
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| Research Institution | KYOTO UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
鈴木 秀之 京都大学, 生命科学研究科, 助教授 (10202136)
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| Keywords | Ntn-ヒドロラーゼ / 活性中心 / γ-グルタミルトランスペプチダーゼ / 大腸菌 / グルタチオン |
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| Research Abstract |
GGTは、古くからセリンプロテアーゼのようにアシル酵素中間体(GGTの場合はγ-グルタミル酵素中間体)形成を経て進行するとされており、小サブユニット内のOH基を持つアミノ酸残基が活性中心であろうとされてきた。しかし、化学修飾剤や部位特異的変異法による多くの研究にもかかわらず、活性中心残基を特定するに至っていなかった。筆者らはグルタミン酸アナログである新規なアフィニティーラベル化剤を用いて、これまでに1次構造の分かっているGGTおよび類似の酵素において完全に保存されている小サブユニットN末端のThr残基が活性中心であることを明らかにした。この化合物は酵素反応に伴って活性残基に不可逆的に結合し、安定なホスホン酸モノエステルを形成し、GGTを失活させた。アフィニティーラベルしたGGTと未修飾のGGTをそれぞれ逆相HPLCにより大サブユニットと小サブユニットに分離した後、イオンスプレー質量分析器で分析したところ、小サブユニットの質量数がラベル化剤1分子分大きくなっており、これまでの報告と同様、小サブユニットに活性中心があることが分かった。小サブユニットをリシルエンドペプチダーゼで切断後、LC-MSで分析したところ、小サブユニットのN末端ペプチド断片がラベルされていた。さらにこのペプチド断片をMS-MSによりペプチド結合部分で断片化させて解析したところ、ラベル化されたアミノ酸残基はN末端のThr-391であった。つまり、プロセッシングにより新たにN末端アミノ酸残基となった小サブユニットN末端のThr-391の側鎖の酸素原子が酵素反応の際の求核原子であり、γ-グルタミル酵素中間体を形成する際にγ-グルタミル化されることが明らかとなった。
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[Publications] Hideyuki Suzuki et al.: "Identification of catalytic nucleophile of Escherichia coli γ-glutamyltranspeptidase by γ-monofluorophosphono derivative of glutamic acid : N-terminal Thr-391 in small subunit is the nucleophile."Biochemistry. 39(26). 7764-7771 (2000)
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[Publications] Hideyuki Suzuki et al.: "Aminopeptidases A, B and N, and dipeptidase D are the four cysteinylglycinases of Escherichia coli K-12."Journal of Bacteriology. 183(4). 1489-1490 (2001)
