免疫電顕およびイムノブロット法を用いたマダイ筋肉の自己消化機構の解明

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10660198
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 原 研治 長崎大学, 水産学部, 教授 (10039737)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 橘 勝康 長崎大学, 水産学部, 助教授 (20171712) ; 石原 忠 長崎大学, 水産学部, 教授 (40039722)
• Keywords: マダイ筋肉 / 自己消化 / プロテアーゼ / 筋原繊維タンパク質 / プロテアーゼインヒビター

Research Abstract

平成10年度は、主として、筋原繊維タンパク分解の解析のため、種々の筋原繊維タンパクの特異抗体を作成した。
「筋原繊維タンパク質の精製」マダイ筋肉から以下の筋原繊維タンパクを精製した。
1) α-アクチニンの精製:筋原繊維粗抽出液からミオシン、アクチンを除去後DEAE-Sepacelカラム、Protein-Pak250カラムのHPLCにより、単一票品に精製した。
以下、筋原繊維粗抽出液から2) ミオシンHC、3) β-コネクチン、4) アクチン、5) トロポミオシン、6) トロポニンを精製した。
「筋原繊維タンパク質の抗体の生成」 精製された全ての筋原繊維タンパクを各ラットに免疫しそれぞれの抗血清を得た。さらに抗血清は抗原カラムを通し、特異IgGとした。これらの特異抗体は、筋肉粗抽出液中のそれぞれの抗体と特異的に反応する事をイムノブロット法で確かめた。
「マダイ筋肉自己消化の予備実験」 マダイを即殺後、25℃に保存し、定期的に背部普通筋を採り、SDS-PAGEにて筋原繊維タンパクの分解を調べた。その結果、保存3日目でミオシンHC、α-アクチニン、トロポニンは完全に分解されていた。
「インヒビターの注入」 マダイのキュヴエ氏管(静脈)にプロテアーゼインヒビターを注入し30分後即殺し、筋肉中の酵素活性を測定することにより、プロテアーゼインヒビターが筋肉まで到達しているかどうかを確かめた。その結果、システインプロテアーゼインヒビターを注入した魚では、筋肉中のカテプシンB,L(システインプロテアーゼ)活性はほぼ阻害されていることがわかった。