胚心臓の内皮細胞を間葉に転換させる生理活性物質の精製と遺伝子クローニング

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 10670027
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 中島 裕司 埼玉医科大学, 医学部, 助教授 (80207795)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉村 和法 埼玉医科大学, 医学部, 助手 (20158497) ; 山岸 敏之 埼玉医科大学, 医学部, 助手 (60255122) ; 穂苅 茂 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (90049859)
• Keywords: 心臓形態形成 / 心内膜床

Research Abstract

心臓弁や房室中隔の原基は初期胚心臓に形成される心内膜床である。心内膜床は心内皮細胞が間葉に形質転換(内皮-間葉形質転換)し形成される。本研究の目的はこの内皮-間葉形質転換を誘導する未知因子を分離精製し、アミノ酸配列、塩基配列を決定することである。【研究実績】1、まず昨年度の申請で作製した目的の抗原を認識しているモノクローナル抗体H8D8が胚心筋培養上清中に産生された抗原を認識しているかを、アイソトープラベルした培養上清から抗原の免疫沈降を行い、フルオログラフィーにて確認した。2、次にH8D8を用いて免疫吸着カラムを作製し、胚心筋培養上清の粗精製標品から抗原の精製を行い、得られたサンプルをSDSPAGEで展開し、膜に転写後、イムノブロットで分子量70万の目的バンドを確認した。3、ついで、この免疫吸着カラムを用いて抗原の大量精製をおこなった。得られた産物をSDSPAGEで展開し、膜に転写後、目的のバンドを切り出しエドマン法にてアミノ酸分析を行ったが、アミノ酸配列を決定することはできなかった。その原因は切り出したバンドに複数のタンパク質が含まれていることが予想された。【今後の展開】上記(3)で得られたバンドは複数のタンパク質が含まれることが予測されるので1、免疫吸着カラムで得られた産物を二次元電気泳動で展開し、イムノブロットで目的のスポットを確認後、各スポットにつきアミノ酸分析を行う。2、胚心筋からcDNAライブラリーを作製し発現ベクターに組み込み、培養細胞に導入し、H8D8を用いてスクリーニングを行った後、遺伝子クローニングを行う。